目的:出血后脑细胞损伤是颅内出血患者常见的致残和致死原因。研究发现出血后脑细胞的损伤可能与血凝块形成过程中产生的大量凝血酶有关。凝血酶是参与凝血过程中“瀑布反应”的关键酶,也是一种多功能的丝氨酸蛋白酶。在脑的星形胶质细胞上存在大量的凝血酶激活受体——蛋白酶激活受体(PARs),凝血酶可能通过PARs介导了星形胶质细胞产生凋亡性损伤反应。抑肽酶是一种从牛肺组织中提取的天然丝氨酸蛋白酶抑制剂,前期研究发现,抑肽酶对PARs活化诱导的细胞生物学效应有调理作用,而其对凝血酶诱导的星形胶质细胞损伤是否有保护性作用尚未明确。本实验以体外培养小鼠原代星形胶质细胞为对象,比较研究了抑肽酶不同剂量预处理对凝血酶诱导的星形胶质细胞损伤的影响,并初步探讨其可能的机制。材料和方法:出生24h内的同窝健康昆明小鼠,分离大脑皮层并进行星形胶质细胞培养,经纯化后纯度达到95%以上者用于实验。实验分两部分:1.凝血酶剂量依赖实验组(T组):比较凝血酶不同剂量对星形胶质细胞的影响,分为五个剂量进行:C(空白培养基对照组),T10(凝血酶10U/ml),T20(凝血酶20U/ml),T50(凝血酶50U/ml),T100(凝血酶100U/ml);2.抑肽酶预处理实验组(A组):探讨抑肽酶不同剂量预处理对凝血酶100U/ml致星形胶质细胞损伤的保护作用,分为六个剂量进行:C(等量培养基对照组),A0(抑肽酶0KIU/ml预处理),A100(抑肽酶100KIU/ml预处理),A300(抑肽酶300KIU/ml预处理),A500(抑肽酶500KIU/ml预处理),A700(抑肽酶700KIU/ml预处理)。流式细胞仪和AO-EB染色法检测细胞凋亡,免疫细胞化学检测细胞凋亡相关基因的表达,彗星电泳检测细胞的DNA损伤,测定培养基内LDH了解细胞膜通透性改变,采用改良的考马斯亮兰R-250染色观察细胞骨架蛋白的形态变化。最后,透射电镜观察抑肽酶预处理对星形胶质细胞超微结构的影响。结果及结论:实验发现:1.经过分离纯化培养的原代星形胶质细胞生长状态良好,经胶质原纤维酸性蛋白 (glial fibrillary acidic protein,GFAP)鉴定,纯度达到95%以上者用于实验。2.凝血酶作用于星形胶质细胞后引起细胞发生明显的突起回缩、细胞间的极性消失并聚集成团,部分细胞核浓缩、染色质边集。剂量越大,改变越早越严重。抑肽酶预处理能明显减轻这种反应,但即使A700也不能完全抑制这种反应。3.经流式<WP=10>细胞仪检测,凝血酶作用于星形胶质细胞后,细胞凋亡率随着凝血酶浓度的增大而升高;抑肽酶可显著降低凝血酶诱导的星形胶质细胞凋亡率,但随着剂量的增大,凋亡率的差别逐渐变小。4.AO-EB染色发现,T组细胞核周围出现分布不均的黄色亮点,随凝血酶剂量增加,黄色亮点逐渐增多增强。抑肽酶预处理后可见细胞形态改变有一定程度的缓解,细胞核周围黄色亮点明显减少,细胞丛集现象也有明显改善。5.凋亡相关基因免疫细胞化学显示,抑肽酶对凝血酶诱导的Bcl-2蛋白表达抑制没有明显的干预作用,而对凝血酶诱导的即刻早期基因—c-fos和c-jun表达增强有显著的促进作用。6.彗星电泳发现,凝血酶引起星形胶质细胞产生典型的DNA“慧尾”,随着凝血酶剂量的增加,慧尾的长度和宽度也随之增加,抑肽酶预处理后慧尾明显变窄、变短。7.自动生化分析仪测定细胞培养基内的LDH结果显示,与C组相比,A0组星形胶质细胞内大量LDH渗漏,抑肽酶预处理能明显减轻LDH的外渗,但抑肽酶各剂量组间无显著性差异。8.采用改良的考马斯亮兰R-250染色方法进行细胞骨架蛋白染色,高倍镜下观察发现,正常细胞的骨架蛋白排列致密,条理清晰,而T组中发生突起回缩变圆的细胞骨架蛋白明显稀疏,发生不同程度的空洞样改变,抑肽酶预处理使发生形态改变的细胞数量明显减少,但少数已发生形态改变的细胞骨架蛋白染色改变同T组。9.透射电镜下,凝血酶100U/ml作用24h后的细胞出现明显的损伤,主要表现为线粒体肿胀,染色质边集,部分成“新月”样改变,细胞整体呈现凋亡早期表现。抑肽酶预处理使线粒体肿胀减轻,多个视野均未见凋亡小体,内质网扩张明显,细胞内可见大量的尼氏体,细胞处于退化状态。由以上实验结果可以得出以下结论:1. 大剂量凝血酶改变了星形胶质细胞内c-fos、c-jun以及Bcl-2基因的表达,而抑肽酶对这些基因的表达有不同程度的影响。2. 抑肽酶对凝血酶诱导的星形胶质细胞细胞膜、细胞骨架蛋白和DNA损伤有明显的抑制作用,但不能完全抑制。3. 抑肽酶可以减轻凝血酶引起的细胞形态改变和超微结构损伤,但不能抑制细胞的退化。4. 大剂量凝血酶作用后可以引起明显的星形胶质细胞凋亡,凋亡程度与剂量呈正相关,而小剂量的抑肽酶即可对其显著抑制。5. 抑肽酶与凝血酶在星形胶质细胞内存在明显的拮抗关系,但它不是凝血酶的完全拮抗剂。