论文部分内容阅读
红花玉兰（Magnolia wufengensis）属木兰科（Magnoliaceae）木兰属（Magnolia）,其种内具有丰富的花色、花型及花被片数目等自然变异,使其成为研究被子植物花器官形态建成和发育演变的理想材料。经典花发育ABCDE模型中AP1是决定外侧花器官特征的MADS-box基因,但已有对基部被子植物和基部双子叶植物中AGL6同源基因表达模式研究推测AGL6同源基因可能具有A类基因功能。为此本文对红花玉兰中APETATAL1-like和AGAMOUS-LIKE 6-like 基因及AP1/SEP/AGL6亚族成员进行同源克隆,分析其表达模式和验证其功能,并研究其蛋白相互作用,以揭示红花玉兰AP1和AGL6同源基因在花被片发育中的作用。主要研究结果如下:1、红花玉兰AP1同源基因的克隆与功能分析红花玉兰仅有一个AP1-like基因,具有FUL motif和paleoAP1 motif结构域,在系统进化树上与木兰类植物FUL同源基因聚类在一起。半定量分析表明MawuAP1在叶片和各轮花器官中均有表达;实时定量结果表明MawuAP1在苞片中表达水平较高,花器官中除心皮外,由外向内表达水平逐渐降低;对转基因拟南芥的表型分析表明MawuAP1能够促进开花和心皮发育,但没有拟南芥AP1决定外侧花器官的功能。2、红花玉兰AGL6同源基因克隆与功能分析（1）红花玉兰AGL6同源基因克隆与系统进化分析从红花玉兰花芽中克隆得到MawuAGL61和MawuAGL62,其编码区碱基相似度81.0%,氨基酸序列相似度81.1%,C区具有AGL6 motif Ⅰ和AGL6 motifⅡ结构域。构建种子植物AGL6-like基因系统进化树并结合其组织表达特异性发现,MawuAGL61/2是最近一次木兰类植物中基因重复事件的产物。（2）MawuAGL61/2表达模式分析半定量结果表明MawuAGL61在花器官中均有表达,MawuAGL62在雄蕊中不表达;实时定量分析表明MawuAGL61/2在花器官发生和花芽快速生长期的花被片中均高水平表达,MawuAGL62在花被片中自外而内表达水平逐渐降低。这一结果表明MawuAGL62参与决定花被片形态发生发育。（3）MawuAGL61/2 功能分析转基因MawuAGL61/2野生型拟南芥出现早花,MawuAGL61使顶生花早现,并在其第一、二轮花器官之间产生外侧花器官残缺的次生花,表明其具有促进开花和决定花原基的功能,MawuAGL62增加花瓣数,表明其参与决定花瓣特征;转基因MawuAGL61/2的ap1-10突变体也早花,MawuAGL61使顶生花早现并出现同样的次生花、花瓣状雄蕊、增加叶状器官,表明其具有决定花瓣和萼片的功能,MawuAGL62恢复ap1-10突变体的花瓣和萼片,表明其参与决定花瓣和萼片发育。二者均有A类基因功能。3、MawuAGL61/2与红花玉兰B、C、E类基因相互作用分析（1）红花玉兰MADS-box基因表达模式分析实时定量分析MawuAGL61/2与B、C、E类基因在红花玉兰及其多瓣红花玉兰花器官中表达模式表明,苞片中仅MawuAP1高水平表达;M MawuAP31/2和MawuPI在花被中自外而内表达水平逐渐降低;雄蕊中MawuAGL61/2表达水平极低。为此推测MawuAGL61/2、MawuAP31/2和MawuPI1共同决定花被片发育。（2）红花玉兰MADS-box蛋白相互作用酵母双杂结果表明MawuAP1与红花玉兰AGL6-like、AP1-like和SEP-like有相互作用;MawuAGL61/2与红花玉兰和拟南芥AGL6-like、SEP-like及自身均有相互作用,而MawuAGL62还与AP1-like有相互作用;它们与B类基因均没表现相互作用;酵母三杂结果表明MawuAGL62与AtSEP3、AtAP3有相互作用,通过形成四聚体以决定花瓣特征。