三七萜类骨架生物合成途径关键酶ispG和GGPPS基因的克隆和表达分析

来源 :广西中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:Aslaen
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目的:根据前期三七转录组测序结果筛选出位于三七萜类骨架生物合成途径中的关键酶香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)及4-羟基-3-甲基-2-烯基二磷酸合酶(ispG),克隆得到GGPPS和ispG基因的全长序列信息,初步分析其结构特征、时空表达规律,探讨其对萜类物质代谢的影响。构建GGPPS原核表达载体,为深入酶的功能研究及品质形成的分子遗传调控提供基础。  方法:在Unigene序列信息基础上,结合cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆出三七ispG及GGPPS基因全长;运用实时荧光定量PCR,采用双标准曲线SYBR法分析三七GGPPS和ispG基因在不同发育时期、不同器官中的时空表达规律;使用pET-30a(+)构建GGPPS原核表达载体pET-30a(+)-GGPPS,转入BL(DE3)宿主菌中诱导表达,获得融合蛋白,并对其进行纯化复性。  结果:实验克隆得到ispG基因cDNA全长序列2284 bp,最长开放阅读框为2223bp,该基因编码740个氨基酸,与绒毛烟草、橡胶树、芝麻的ispG一致性达到89%以上,具有GcpE超家族结构域;实时荧光定量PCR结果显示,ispG基因在1、2、3年生三七的根、茎、叶和3年生的花等不同器官组织中均有表达,但以叶中具有显著水平的高表达量,其他组织部位表达量均较低。GGPPS基因cDNA序列全长1203bp的,最长开放阅读框为1035 bp,GeneBank登录号为:KM486564,相应基因全长2370bp,包含1个内含子和2个外显子,该基因编码344个氨基酸,与蓖麻、丹参等植物GGPPS的一致性达到73%以上,具有富天冬氨酸区等多个保守结构域,属于类异戊二烯合成酶超家族;实时荧光定量PCR结果显示,GGPPS在1、2、3年生三七的根、茎、叶和3年生的花等不同器官组织中均有表达,但以3年生叶中具有显著水平的高表达量。构建的得到的pET-30a(+)-GGPPS原核表达体系能够成功表达出pET-30a(+)-GGPPS融合蛋白,实验考察确定该蛋白的最佳诱导条件为:0.1mmol·L-1 IPTG,诱导6h,该蛋白主要以包涵体形式存在于细胞内,通过Ni-NTA的纯化,能够得到纯度较高的融合蛋白。  结论:克隆得到三七ispG和GGPPS基因,结合ispG和GGPPS两个基因时空表达规律的研究,以及生物信息学分析,认为这两个基因均参与萜类骨架生物合成途径,影响三萜的积累和三七品质的形成;与三七叶片叶绿体的发育、叶绿素和类胡萝卜素的合成,以及三七的阴生适应性相关。通过对GGPPS原核表达获得pET-30a(+)-GGPPS的融合蛋白,为后续酶的活性功能验证奠定基础。总之,本文克隆了两个三七萜类生物合成骨架关键酶基因,初步分析了其时空表达和生物学功能,为研究三七品质的形成、三七阴生的生态生理习性与其品质形成的关联性,以及基于分子遗传调控的三七品质改良等提供了基础。
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