背景脊髓损伤(spinal cord injury)最主要的原因是外伤导致的骨折,可以压迫脊髓导致出现脊髓损伤,也可以因外伤以后出现的脊髓震荡导致脊髓挫伤。机械性损伤导致的骨折会压迫脊髓,损伤脊髓神经元,轴突及血管进而引起继发脊髓损伤。继发性脊髓损伤主要包括缺氧,兴奋性化学物质的释放,空洞形成,炎性细胞浸润,纤维胶质瘢痕形成及慢性脱髓鞘病变等。目前有研究发现自噬能促进有害蛋白和受损线粒体的清除,抑制神经元细胞的死亡和丢失,但其分子机制还不甚清楚。临床上除了使用激素(甲基强地松龙)有一定的效果外,科学家们正不断创新和测试更多的神经保护疗法,防止创伤后损伤扩大,保护神经组织。自噬(autophagy)是一种溶酶体降解途径,有利于维持细胞内稳态,可分为自噬体形成、自噬体与溶酶体结合形成自噬溶酶体及自噬溶酶体内消化三个主要过程。在透射电镜下可见自噬的全过程,它是检测自噬体的金指标。另外也可检测自噬体膜上标志性蛋白质微管相关蛋白1的轻链3(LC3)。线粒体是重要的细胞器,它的主要作用是通过氧化磷酸化提供能量和维持细胞内稳态。线粒体自噬(mitophagy)是自噬体吞噬包裹功能失调或多余的线粒体运送至溶溶酶体进行消化,以达到维持细胞内稳态,控制线粒体数量的目的。在不同的种属和疾病中已经发现了线粒体自噬的存在。我们在之前的研究中发现脊髓损伤及缺氧后的神经元细胞中有线粒体自噬的存在,也发现了线粒体自噬相关蛋白BNIP3和NIX的表达升高。NIX(也称BNIP3L)属于Bcl2家族成员,是位于线粒体外膜的线粒体自噬受体。目前NIX介导自噬有两个确切的机制,一是与NIX引起线粒体损伤后活性氧(reactive oxygen species,ROS)蓄积导致自噬,二是NIX通过BH3结构域与Beclin1竞争结合Bcl2导致细胞中游离的Beclin 1增加而引起自噬。另外一个可能的机制是NIX作为自噬受体招募自噬相关分子而启动自噬。我们在之前的研究中发现NIX的同源分子BNIP3和LC3之间存在相互作用进而引起线粒体自噬。目前脊髓损伤后自噬的调控机制报道不多,因此我们猜想NIX可能参与了这个过程。而且NIX是可磷酸化蛋白,有报道S34/S35磷酸化能增强NIX与LC3之间的相互作用,因此我们设想,磷酸化也是自噬的调控靶点之一。因此,本研究将检测脊髓损伤和PC12细胞缺氧后NIX的表达,探索NIX与自噬及线粒体自噬之间的联系,验证NIX与LC3的相互作用,观察NIX磷酸化对自噬的影响以及抑制NIX对PC12细胞自噬的影响等,明确NIX在脊髓损伤后神经元线粒体自噬中的作用。目的研究大鼠脊髓损伤和PC12细胞缺氧不同时间点NIX的表达变化及意义,探索PC12细胞中NIX与自噬及线粒体自噬之间的关系,检测NIX与LC3的相互作用,NIX磷酸化对自噬的影响,观察抑制NIX后对神经元细胞自噬的影响,旨在发现脊髓损伤后NIX介导神经元线粒体自噬的新通路,为脊髓损伤的治疗提供新的方向。方法1.将28只雄性SD大鼠随机分为假手术组,脊髓损伤6h、12h、24h、48h、72h、96h组,每组四只,制作大鼠Allen’s脊髓损伤模型。培养PC12细胞,分为缺氧0h、6h、12h、24h、48h组。不同的干预处理后提取蛋白免疫印迹(Western blot)检测NIX,LC3,TOMM20,COX4的表达变化。2.培养PC12细胞,分别转染RFP-NIX,GFP-NIXshRNA及相应的对照病毒,Western blot和激光共聚焦显微镜检测NIX,LC3的变化情况。3.培养PC12细胞,共转染mito-RFP和GFP-LC3,观察常氧和缺氧条件下线粒体的变化情况,共转染RFP-NIX和GFP-LC3,激光共聚焦显微镜观察线粒体-NIX-LC3-自噬体膜复合体,CoIP检测NIX与LC3的相互作用。PC12细胞分别转染腺病毒NIXshRNA,NIXΔTM常氧条件下培养24h后再缺氧培养24h,激光共聚焦显微镜观察线粒体的完整性,Western blot检测NIX,LC3,TOMM20,COX4等的变化情况。4.培养PC12细胞,共转染RFP-NIX和GFP-LC3,培养42h后分别加入OA(50nm),K252c(16um)及等量的PBS继续培养6h。Western blot检测LC3的变化情况,激光共聚焦显微镜观察线粒体-NIX-LC3-自噬体膜复合体改变情况。5.制作大鼠Allen’s脊髓损伤模型,分为假手术组,SCI组,SCI+Ad-control组,SCI+Ad-NIXshRNA组。治疗28天后激光共聚焦显微镜观察各组Neun阳性细胞的数量,Western blot检测NIX的变化情况,HE染色观察脊髓组织坏死区域的大小变化。BBB评分评价大鼠后肢运动功能情况。结果1.脊髓损伤和缺氧条件下NIX,LC3,TOMM20,COX4表达的变化我们发现脊髓损伤6h后NIX开始逐渐升高96h达到高峰(p<0.05),LC3-I的表达基本没改变,LC-II在脊髓损伤损伤6h后开始升高72h达到高峰(p<0.05),线粒体外膜蛋白TOMM20和线粒体内膜蛋白COX4在脊髓损伤12h后开始逐渐降低(p<0.05)。在缺氧模型中,NIX和LC3-II在缺氧12h后开始升高,24h达到高峰(p<0.05),TOMM20和COX4在缺氧12h后开始逐渐降低(p<0.05)。2.过表达NIX对PC12细胞LC3-II表达变化的影响我们发现NIX过表达能导致LC3-II的表达升高(p<0.01),在缺氧诱导的自噬条件下NIXshRNA能减少LC3的表达。这说明NIX与自噬之间存在相互联系。3.线粒体-NIX-LC3-自噬体膜复合体的形成及抑制NIX对PC12细胞的影响我们用Mito-RFP腺病毒标记线粒体,发现在缺氧诱导的自噬条件下线粒体发生了破坏,并与GFP-LC3标记的自噬体膜结合发生了线粒体自噬。在NIX过表达诱导的自噬条件下,我们用激光共聚焦显微镜进一步发现了线粒体-NIX-LC3-自噬体膜复合体结构,CoIP证明NIX与LC3之间存在相互作用。缺氧条件下抑制NIX能保护线粒体的完整性,降低LC3-II/LC3-I的比值(p<0.05),提高TOMM20的表达量(p<0.05)。4.OA和K252c对线粒体自噬的影响首先我们通过Western blot检测了各组LC3-II/LC3-I的比值变化情况,跟对照组相比我们发现OA能提高LC3-II的表达水平(p<0.05),K252c能降低它们的比值(p<0.01)。通过激光共定位观察发现这种改变是发生在线粒体的,说明它们能影响线粒体自噬。5.抑制NIX后对大鼠运动功能恢复的影响脊髓损伤的大鼠在经过Ad-NIXshRNA和Ad-control治疗28天后,首先Western blot检测了各组NIX的变化情况,我们发现NIX的表达量在Ad-NIXshRNA治疗组和Ad-control治疗组均较假手术组明显升高(p<0.01),但Ad-NIXshRNA组的NIX表达量表达Ad-control组降低(p<0.01)。然后用Neun阳性细胞的比例来评价各组存活神经元的情况,其中假手术组比例最高(p<0.01),其次是NIXshRNA治疗组(p<0.05),对照组最少(p<0.05)。HE染色发现Ad-NIXshRNA治疗组坏死的脊髓区域较Ad-control治疗组明显减少。BBB行为学评分发现SCI组、Ad-NIXshRNA治疗组在脊髓损伤14天后开始出现统计学差异(p<0.01),在整个治疗过程中,SCI组与Ad-control治疗组之间无差异(p>0.05)。结论1.大鼠脊髓损伤和PC12细胞缺氧能引起NIX和LC3-II的表达升高2.NIX过表达能诱导PC12细胞发生自噬3.NIX和LC3相互作用介导PC12细胞线粒体自噬的发生4.OA能增强线粒体自噬,K252c能减弱线粒体自噬5.抑制NIX能促进脊髓损伤后大鼠下肢运动功能的恢复综上,我们发现脊髓损伤后NIX介导神经元线粒体自噬的新通路,为脊髓损伤的治疗提供了新的方向。