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血吸虫病是临床上常见的慢性寄生虫病,其危害程度仅次于疟疾。在全球范围内,有过2.3亿人感染血吸虫病,波及76个国家和地区,每年因血吸虫相关疾病死亡的患者至少有20万。血吸虫病的主要危害是虫卵肉芽肿的形成以及由虫卵诱导的一系列免疫反应引发的肝纤维化,主要特征为大量细胞外基质沉积于肝脏,严重影响肝功能,甚至导致肝衰竭,而肝星状细胞被认为是细胞外基质的主要来源细胞。目前,血吸虫病主要生物防治措施是进行吡喹酮治疗,但在临床上,吡喹酮对血吸虫感染所造成的肝肉芽肿及肝纤维化无明显改善作用,且吡喹酮的耐药性和化学毒性也限制了其应用。因此,寻找有效的防治肝纤维化策略对血吸虫病患者的生活质量以及疾病预后的改善有着十分重要的意义。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长度较短的非编码RNA分子,可与靶基因mRNA的3’端非编码区互补结合,从而抑制靶基因的翻译或促进靶基因mRNA的降解。在转录后水平负调控基因表达。研究表明,miRNA在肝脏疾病及肝纤维化中具有重要的调控作用,其有望成为未来抗肝纤维化治疗的药物靶点。MiR-181b-5p在小鼠感染血吸虫后表达明显升高,并且细胞实验也发现其对肝星状细胞的活化具有重要作用。因此,本研究拟以miR-181b-5p为研究对象,旨在通过对血吸虫病肝纤维化的发生、发展机制的深入研究,探索可能的抗肝纤维化治疗靶点,为临床血吸虫病的防治及肝纤维化的治疗提供理论依据。目的:本研究围绕miR-181b-5p分别从动物水平和细胞水平探讨血吸虫病肝纤维化的发生、发展机制,明确miR-181b-5p在血吸虫病进程中的动态变化,并通过干预miR-181b-5p的表达进一步研究其对肝纤维化的调控作用,为基于miR-181b-5p的基础与临床血吸虫病防治干预策略提供实验依据。方法:小鼠造模方法:雌性BALB/C小鼠,6-8周龄、体重20-22克,经腹部皮肤感染15-20条日本血吸虫尾蚴,建立血吸虫感染模型。动物实验:(1)明确血吸虫病过程中miR-181b-5p表达的动态变化:随即分为2组:①对照组:不做任何处理;②模型组:尾蚴腹部感染造模。所有小鼠分别于感染后6周、8周、10周取材检测相关指标。(2)探索miR-181b-5p调控血吸虫病肝纤维相关机制:于小鼠尾蚴腹部感染造模10天后,通过尾静脉注射重组8型腺相关病毒(recombinant adeno-associatedvirus8,rAAV8)特异性 miR-181b-5p 抑制载体 miR-181b antagomir,阴性对照组给予对照病毒,空白组给予PBS尾静脉注射,于感染后第8周取材检测。细胞实验:采用TGF-β1诱导人肝星状细胞LX2活化,模拟体内肝纤维化发生过程,以细胞水平miR-181b-5p的表达变化;后期通过转染miR-181b-5p mimic或inhibitor以上调或下调miR-181b-5p表达,进一步探明miR-181b-5p对肝星状细胞活化以及肝纤维化发生的相关作用机制。数据统计:主要采用单因素方差分析及显著性Student-T检验进行分析,P<0.05表示差异具有统计学意义。结果:(1)血吸虫感染后miR-181b-5p随感染周期延长而逐渐升高(RT-PCR),Smad7表达随感染周期延长而逐渐降低(Western Blot);(2)下调miR-181b-5p可显著减轻血吸虫感染小鼠肝肉芽肿及肝纤维化(HE染色/masson染色),抑制肝纤维化相关基因COL1A1表达(RT-PCR/Western Blot),降低肝纤维化相关细胞因子 TGF-β1 释放(ELISA),升高Smad7 蛋白表达(RT-PCR/Western Blot);(3)不同浓度 TGF-β1(5ng/ml,10ng/ml,15ng/ml)刺激 LX2 细胞,miR-181b-5p呈升高趋势,以10ng/ml表达最高;10ng/ml TGF-β1处理后6h、12hmiR-181b-5p表达稍有下降,24h、48h后显著上调,以24h升高最为显著;(4)下调LX2细胞miR-181b-5p表达可显著降低TGF-β1诱导的LX2细胞COL1A1表达升高。结论:(1)小鼠感染血吸虫后肝组织miR-181b-5p表达逐渐升高,Smad7表达逐渐降低;(2)下调miR-181b-5p表达可显著减轻血吸虫病小鼠肝肉芽肿及肝纤维化;(3)miR-181b-5p可通过靶向Smad7促进血吸虫病肝纤维化,而抑制miR-181b-5p表达,可促进其下游基因Smad7表达,从而发挥抗纤维化作用。