应用RNAi技术沉默RhoC基因调控炎性乳腺癌增殖、侵袭和转移的实验研究

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目的:炎性乳腺癌是原发性乳腺癌中恶性度最高的肿瘤,约占全部乳腺癌的1%-6%。IBC亦是一种特殊的局部晚期乳腺癌,肿瘤细胞侵袭性和转移性强,死亡率非常高。IBC组织学无明显特异性,可表现为浸润性导管癌、小叶细胞癌等,常见血管和淋巴管癌栓。IBC肿瘤细胞呈低分化,并多伴局部淋巴结浸润。由于IBC恶性程度极高,病情发展迅速,早期即有全身广泛转移而危及生命,预后非常差。当前临床上主要采取以手术、放疗、化疗等综合治疗措施来处理这类疾病,但是治疗效果极其有限。近年来,有研究发现,癌基因RhoC在绝大多数炎性乳腺癌中广泛表达,并且参与IBC的生长、侵袭和转移等生物学活动。这一发现为IBC的分子靶向治疗提供了方向。本研究旨在探讨利用RNA干扰技术沉默IBCSUM190细胞株RhoC基因,分析其对IBC SUM190细胞增殖、侵袭和转移能力的影响。方法:收集66例乳腺良性疾病组织和94例乳腺癌组织,采用免疫组化方法,应用彩色图像灰度扫描分析系统检测RhoC蛋白的表达,并分析其临床意义。在体外实验中,人IBC SUM190细胞随机分成对照组与实验组,对照组不加转染试剂仅加细胞培养液,实验组加入转染试剂脂质体2000和相关试剂正常转染。以脂质体介导的RhoC-siRNA转染人IBC SUM190细胞株。转染后48小时,以半定量RT-PCR检测人IBC SUM190细胞中RhoC mRNA的表达水平,以Western blot法测定人IBC SUM190细胞中RhoC蛋白的表达水平。在转染后0、24、48、72小时时间点,以MTT法检测人IBC SUM190细胞生长情况。细胞生长速度以吸光度A值表示。在转染后48小时,应用流式细胞仪检测人IBC SUM190细胞的凋亡情况。应用transwell小孔法检测人IBC SUM190细胞的侵袭和转移能力的变化。在细胞侵袭实验中,穿膜细胞数代表肿瘤细胞侵袭能力;在细胞转移试验中,穿膜细胞数代表肿瘤转移运动能力。采用RT-PCR法检测RhoC-siRNA转染人IBC SUM190细胞后KAI1、MMP9、CXCR4 mRNA的表达。另外,采用免疫细胞化学法分析RhoC-siRNA转染后人IBC SUM190细胞中KA1、MMP9、CXCR4蛋白的表达情况。结果:RhoC蛋白在乳腺良性疾病组织和乳腺癌组织中表达的平均灰度值分别为(0.051±0.014)、(0.328±0.122),二者之间差异有统计学意义(P<0.01)。RhoC蛋白在年龄<45岁和≥45岁乳腺癌中表达的平均灰度值分别为(0.307±0.111)、(0.358±0.172),二者之间差异无统计学意义(P>0.05)。无腋淋巴结转移乳腺癌中RhoC蛋白表达的平均灰度值(0.266±0.107),有腋淋巴结转移乳腺癌中RhoC蛋白表达的平均灰度值(0.409±0.187),二者之间差异有统计学意义(P<0.05)。Ⅰ+Ⅱ期乳腺癌中RhoC表达的平均灰度值(0.237±0.088),Ⅲ期乳腺癌中RhoC表达的平均灰度值(0.435±0.211),二者之间差异有统计学意义(P<0.05)。在体外实验中,以RhoC-siRNA转染人IBC SUM190细胞,发现转染效率可以达到70%。转染后48小时,对照组中人IBC SUM190细胞RhoC mRNA表达水平(0.907±0.387),实验组中人IBC SUM190细胞RhoC mRNA表达水平(0.367±0.152),二者之间差异有统计学意义(P<0.01)。对照组中人IBC SUM190细胞RhoC蛋白表达水平(0.914±0.389),实验组中人IBC SUM190细胞RhoC蛋白表达水平(0.375±0.164),二者之间差异有统计学意义(P<0.01)。在转染后0、24、48、72小时各时间点,对照组人IBC SUM190细胞生长速度(吸光度A值)分别为(0.43±0.09)、(0.57±0.20)、(1.32±0.48)、(1.88±0.68),实验组人IBC SUM190细胞生长速度(吸光度A值)分别为(0.45±0.12)、(0.50±0.17)、(1.28±0.40)、(1.75±0.57),四个时相点二者之间的差异均无统计学意义(P>0.05)。对照组IBC SUM190细胞G0/G,期细胞比例(52.26±3.68)%,实验组IBC SUM190细胞G0/G1期细胞比例(55.38±3.85)%,二者之间差异无统计学意义(P>0.05)。对照组IBC SUM190细胞S期细胞比例(23.78±1.42)%,实验组IBC SUM190细胞S期细胞比例(21.15±1.26)%,二者之间差异无统计学意义(P>0.05)。对照组人IBC SUM190细胞凋亡率(4.77±0.34)%,实验组人IBC SUM190细胞凋亡率(5.25±0.45)%,二者之间差异无统计学意义(P>0.05)。在细胞侵袭实验中,对照组人IBC SUM190细胞穿膜细胞数(352.2±50.6),实验组人IBC SUM190细胞穿膜细胞数(85.6±12.7),二者之间差异有统计学意义(P<0.05)。在细胞转移实验中,对照组人IBC SUM190细胞穿膜细胞数(189.6±23.3),实验组人IBC SUM190细胞穿膜细胞数(46.6±7.7),二者之间差异有统计学意义(P<0.05)。RhoC-siRNA转染人IBC SUM190细胞48小时后,对照组、实验组KAI1 mRNA表达水平分别为(0.462±0.192)、(0.762±0.281),二者之间差异有统计学意义(P<0.05)。对照组、实验组MMP9 mRNA表达水平分别为(0.889±0.349)、(0.587±0.212),二者之间差异有统计学意义(P<0.05)。对照组、实验组CXCR4 mRNA表达水平分别为(0.873±0.331)、(0.620±0.277),二者之间差异有统计学意义(P<0.05)。KAI1蛋白在对照组和实验组中表达分别为(0.54±0.11)、(1.13±0.39),二者之间差异有统计学意义(P<0.05)。MMP9蛋白在对照组和实验组中表达分别为(1.28±0.45)、(0.68±0.20),二者之间差异有统计学意义(P<0.05)。CXCR4蛋白在对照组和实验组中表达分别为(1.35±0.50)、(0.77±0.23),二者之间差异有统计学意义(P<0.05)。结论:RhoC蛋白在原发性乳腺癌组织中高表达,其表达与肿瘤病理特征密切相关。肿瘤恶性度高,RhoC蛋白相应高表达。RhoC表达与乳腺癌淋巴结转移、TNM分期呈正相关。RhoC在人IBC SUM190细胞中广泛表达,在IBC的发生、发展中发挥重要作用。通过RNA干扰靶向沉默RhoC基因,可以调控RhoC蛋白低表达,从而显著抑制IBC SUM190细胞的侵袭和转移能力,但是并不能限制IBC SUM190细胞的增殖活动。
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