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研究目的肺癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率也高居世界首位。根据组织病理学特点肺癌可分为两大类:小细胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）,其中85%肺癌的病理类型为NSCLC。目前NSCLC最有效的治疗方法是手术治疗,但由于早期难以发现、易发生转移和耐药等原因,难以实现有效根治,NSCLC患者的5年生存率不足20%。化疗是治疗NSCLC的另一重要手段,但最终都不可避免的发生转移或者耐药。肿瘤细胞侵袭和转移几乎是所有癌症治疗失败的主要原因,肿瘤细胞耐药也是彻底清除肿瘤的一大障碍。因此,深入了解NSCLC细胞侵袭转移及耐药的具体分子机制,进一步探索有效的治疗策略,是提高治疗效果和患者生存率的关键。肿瘤细胞侵袭转移和耐药的发生除受自身基因的调控外,还受到肿瘤微环境多方面的影响。肿瘤细胞可通过分泌多种细胞因子影响肿瘤微环境细胞的增殖和分布,同时后者也可做出应答,如为肿瘤组织提供骨架支撑,分泌多种因子促进肿瘤组织血管生成,促进肿瘤细胞增殖、侵袭和耐药等。存在于肿瘤组织中的成纤维细胞统称为肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts,CAFs）,是肿瘤微环境主要的组成成分之一。CAFs能分泌多种细胞因子促进肿瘤血管生成,诱导肿瘤细胞发生上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）,打破组织细胞之间的稳态使微环境更适合肿瘤生长。大量研究表明,CAFs可促进乳腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、卵巢癌等多种癌症的增殖、侵袭转移和耐药的发生,但是有关其在肺癌中作用的研究报道较少。因此,本课题主要对CAFs在肺癌细胞增殖、侵袭转移和耐药中的作用进行研究,以期为肺癌的治疗提供新的思路。内容和方法1.建立成纤维细胞系:收集临床肺癌手术标本,分别从肿瘤组织和癌旁组织中通过组织研磨和消化,分离CAFs和癌旁成纤维细胞（normal fibroblasts,NFs）,利用显微镜观察形态、PCR、免疫荧光和Western blot检测α-SMA、FAP等成纤维细胞标志蛋白确保成纤维细胞提纯成功。2.观察CAFs对NSCLC细胞增殖、侵袭转移等的作用:收集各成纤维细胞条件培养基（cancer-associated fibroblasts conditioned medium,CAF-CM;normal fibroblasts conditioned medium,NF-CM）,经显微镜观察及划痕、小室及CCK8实验,检测CAF-CM对肺癌细胞系形态、侵袭、迁移和增殖的影响。利用Western blot和PCR检测NSCLC细胞中侵袭转移相关基因（MMP2,MMP9,VEGF）和EMT相关分子（E-cadherin,N-cadherin,Vimentin）表达水平变化。3.研究CAFs促进NSCLC细胞系增殖、侵袭转移等的作用机制:利用ELISA检测CAF-CM和NF-CM中IL-6的含量,用Western blot和PCR检测经CAF-CM和NF-CM刺激后肺癌细胞系中IL-6表达量变化,使用重组人IL-6及IL-6中和抗体进一步明确IL-6的作用。Western blot和PCR检测经CAF-CM和NF-CM刺激后肺癌细胞系中IL-6下游侵袭转移相关蛋白p-JAK2,p-STAT3表达量变化,并结合JAK2抑制剂AG490及STAT3抑制剂Stattic进一步明确JAK2/STAT3通路的作用。4.CAFs促进NSCLC细胞增殖、侵袭转移作用的体内研究:将肺癌A549细胞单独或与CAFs混种于裸鼠皮下,观察体内CAFs对肿瘤生长的影响。6周后将裸鼠处死剥出瘤组织并测量肿瘤体积,利用Western blot检测瘤组织内相关蛋白水平的变化,明确体内CAFs对NSCLC细胞的影响。5.CAFs对NSCLC细胞顺铂敏感性的影响:利用CCK8检测顺铂对CAF-CM刺激前后NSCLC细胞的IC50,检测CAF-CM对肺癌细胞顺铂敏感性的影响。6.CAFs增强NSCLC细胞耐药的作用机制:通过Western blot和PCR检测CAF-CM刺激前后肺癌细胞系中ANXA3蛋白表达水平的变化。过表达或敲低ANXA3后检测NSCLC细胞细胞系顺铂敏感性变化及凋亡相关蛋白p-JNK、Survivin、cleaved Caspase8及cleaved Caspase3表达水平的变化。抑制JNK通路后,检测经CAF-CM刺激或过表达ANXA3的肺癌细胞在顺铂作用下的IC50及凋亡相关蛋白的表达量。7.CAFs增强NSCLC细胞耐药的体内研究:将A549细胞单独或与CAFs混合后种于裸鼠皮下,成瘤后腹腔注射顺铂,6周后剥出瘤组织Western blot检测瘤组织中相关蛋白变化,体内验证CAFs对肺癌细胞顺铂敏感性的影响。结果1.从肺癌手术样本中分离的成纤维细胞,镜下观察呈长梭形,α-SMA,FAP等成纤维细胞标志蛋白在mRNA和蛋白水平都高表达,表明分离的成纤维细胞即为肿瘤相关成纤维细胞。2.与NFs相比,CAFs能显著促进肺癌细胞侵袭迁移和增殖,并能上调肺癌细胞中转移相关基因MMP2,MMP9,VEGF的表达,促进肺癌细胞发生上皮间质转化（EMT）。CAF-CM中IL-6含量较高,重组人IL-6可发挥与CAF-CM相似作用,而IL-6中和抗体可显著削弱CAF-CM的促进侵袭转移作用;经CAF-CM和重组人IL-6处理的肺癌细胞中p-JAK2,p-STAT3表达上调,抑制剂JAK通路可显著削弱CAF-CM和重组人IL-6对NSCLC细胞侵袭转移的促进作用。将CAFs与NSCLC细胞A549混种于裸鼠皮下,可显著促进肿瘤生长,癌样本中相关蛋白水平变化与体外结果一致。3.CAF-CM作用可使NSCLC细胞对顺铂的敏感性降低。CAFs中ANXA3的表达水平明显高于NFs,经CAF-CM刺激后NSCLC细胞中ANXA3的表达亦上调。在顺铂作用下,过表达ANXA3或经CAF-CM刺激后NSCLC细胞中p-JNK、Survivin表达上调,cleaved Caspase8及cleaved Caspase3表达下调,凋亡减少;而敲低ANXA3后p-JNK、Survivin表达下调,cleaved Cspapse8及cleaved Cspapse3表达上调,凋亡增加。抑制JNK通路后,CAF-CM和ANXA3促进NSCLC细胞对顺铂耐药的作用被显著削弱。动物实验表明,在顺铂作用下,与CAFs混种组的瘤体积明显大于单种A549组,肿瘤样本中相关蛋白水平的变化与体外一致。结论我们成功从肺癌组织中分离、鉴定了CAFs。本研究首先检测了CAFs对肺癌侵袭转移的作用。结果显示,CAFs可通过分泌IL-6,进而激活NSCLC细胞中的JAK2/STAT3通路,促进后者发生EMT,上调侵袭转移相关基因的表达从而促进肺癌细胞侵袭转移。接下来研究了CAFs对肺癌细胞耐药的作用。结果显示,CAFs还可通过上调ANXA3的表达进而激活NSCLC细胞中JNK/Survivin通路,增强肺癌细胞对顺铂耐药。