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发热是临床上各种疾病,尤其一些传染性疾病的常见症状,也是机体对感染和创伤等的一种全身反应。如何缩短退热时间,缓解病后体虚、神疲乏力、免疫机能低下、骨质疏松、失眠等症状,较快消除抗病毒药物、抗生素、激素所致不良反应,减少激素用量减停过程中出现的病情反跳或加重,成为目前迫切需要解决的问题。中医中药特别是清热解毒类复方,在治疗发热性疾病时日益显示出其相对于单纯西医治疗的优越性及组方的合理性。脑热清口服液(Nao Re Qing Oral likuid,NRQ)在临床上是治疗颅脑手术后顽固性发热的有效中药剂型,为探讨其清热解毒机制,本实验复制家兔内毒素(Endotoxin,ET)和内生致热原(Edogennous pyrogen,EP)性发热模型,首先从整体观察脑热清对发热动物的体温的影响;在获得解热效应的基础上,检测中枢致热性细胞因子、发热介质和解热介质的含量;同时复制氢化可的松所致小鼠免疫抑制模型,观察脑热清对其特异性免疫功能及非特异性免疫功能的调节作用;体外实验采用原代培养小鼠腹腔巨噬细胞,使用激光共聚焦显微镜技术观察脑热清对巨噬细胞内活性氧和游离钙离子的调节。从整体、细胞和分子水平系统探讨脑热清清热解毒的机制。 实验共分为三部分。 第一部分:脑热清口服液对发热家兔的解热作用及其机制。 分别复制 ET 和 EP 性发热家兔模型,以阿司匹林(Aspirin,ASP)作为阳性对照,首先观察 NRQ 的解热效果:(1)NRQ 组的最大体温上升高度(ΔT)和体温反应指数(thermal response index, TRI)与生理盐水对照组相比无明显差异(P > 0.05);(2)ET 和 EP 组的ΔT 和 TRI显著高于生理盐水对照组(P < 0.01);(3)NRQ 和 ASP治疗组动物体温上升峰值明显低于 ET 和 EP 组(P < 0.01),比较脑热清和阿司匹林两种药物对家兔的解热效果,未见明显差异(P > 0.05)。结果表明:脑热清对家兔 ET和 EP 性发热具有明显的解热作用。 在获得解热效应的基础上,进一步探讨该药的解热机制,结果显示:(1)NRQ 对正常家兔下丘脑 IL-1β、下丘脑和脑脊液的 cAMP 及腹中隔区 AVP 的含量无明显影响(P > 0.05)。(2)NRQ 和 ASP 均可以明显降低 ET 和 EP 性发热家兔下丘脑 IL-1β的含量(P <0.01),并且各组下丘脑 IL-1β的含量与体温变化成正相关(r = 0.850,P <0.05),表明脑热清可以显著降低发热动物的中枢致热性细胞因子;(3)NRQ 和 ASP 治疗组下丘脑和脑脊液的 cAMP 含量均显著低于 ET 和EP 组(P <0.01),下丘脑和脑脊液 cAMP 含量变化与体温变化呈显著正相关(HP:r = 0.940,P <0.01;CSF:r = 0.971,P <0.01),表明脑热清可以降低发热家兔中枢发热介质的含量;(4)NRQ 和 ASP 治疗组腹中隔区 AVP 的含量分别与 ET 和 EP 组相比,均具有显著性差异(P <0.01),AVP 含量变化与体温变化也呈正相关(r = 0.777, P <0.05),结果表明脑热清可以增加中枢解热介质的释放。 第二部分:脑热清口服液对小鼠的免疫调节作用。 <WP=4>2 脑热清口服液清热解毒机制的实验研究 以氢化可的松攻击小鼠,建立小鼠免疫抑制模型,并用脑热清高、中、低剂量分别进行干预。(1)单纯灌服脑热清口服液高、中、低组的脾淋巴细胞增殖率和腹腔巨噬细胞(Pmf )吞噬活力与对照组比较无显著性差异(P > 0.05)。(2)模型组 T、B 淋巴细胞增殖率明显降低(P < 0.01),分别是对照组的 45.40%,50.69%;模型组的巨噬细胞吞噬活力比对照组明显下降(P < 0.01),只达到对照组的 62.46%。(3)而脑热清口服液的高、中、低三剂量组均可协同 ConA 和 LPS 促进T、B 淋巴细胞的增殖(P < 0.01)。高、中、低剂量的 T 淋巴细胞增殖率分别比模型组提高了 61.38%,38.75%和 21.20%,其中高剂量组尤为明显。脑热清口服液高、中、低三剂量组的 B 淋巴细胞增殖率分别比模型组的提高了78.72%,60.52%和 49.57%;脑热清口服液高、中、低三剂量组均能增强 Pmf 的吞噬功能(P < 0.01),其高、中、低三剂量组分别比模型组提高 56.11%,33.23%和 31.03%。结果表明,脑热清对免疫功能低下具有很好的调节作用,能够提高其特异性及非特异性免疫功能,而对正常的免疫系统无明显的调节作用。 第三部分:脑热清口服液对小鼠腹腔巨噬细胞内活性氧及游离钙的作用。原代培养小鼠腹腔巨噬细胞,分别以荧光探针二氯荧光素二酯(H2 DCFDA)和 Fluo-3-AM 标记,激光共聚焦显微镜系统 488nm 激发观察荧光强度变化。(1)以 NRQ 刺激培养的小鼠腹腔巨噬细胞,发现 H2DCFDA 的荧光强度明显增强,与静息水平相比,NRQ 刺激后 60s,120s, 330s,540s,1080s 上升幅度分别是 324%,498%,586%,530%,410%,随后稳定在410%上下,波动幅度小于 100,持续至 1500s;(2)未加任何刺激物时,单个巨噬细胞内 Fluo-3 荧光强度无明显变化。以 NRQ 刺激小鼠腹腔巨噬细胞,发现 Fluo-3-AM 的荧光强度明显增强,NRQ 刺激后 30s,90s,270s,360s,630s,上升幅度分别是 982%,1219%,1136%,1052%,963%,随后稳定在 963%上下,波动幅度小于 200,持续至 1500s。结果表明:脑热清能够激活巨噬细胞,使其发生呼吸爆发,产生活性氧,并进一步刺激细胞内游离钙离子释放,有利于巨噬细胞杀灭病原微生物,适度发挥抗?