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根据市场调查显示,猪肉是市民需求量最多的肉制食物。猪圆环病毒(Porcine Circovirus Type,PCV)中的猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus Type 2,PCV2)是影响猪生长发育及繁殖的困扰因素之一。猪圆环病毒2型是引起是断奶仔猪多系统衰竭综合征(Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS)的主要病原,从而给养猪业带来巨大的经济损失。因此,有必要开发出一种定性、定量快速检测猪的PCV2的方法。本实验室已建立PCV2荧光定量PCR快速定性、定量检测技术,并且用该技术研制出试剂盒,命名为猪圆环病毒2型(PCV2)荧光定量PCR快速检测试剂盒,目前处于药证申报阶段。本实验采用荧光定量PCR技术来定性和定量检测PCV2,通过制作标准曲线进行定量检测病毒含量。可通过此方法判断感染猪患PCV2的程度,进行检测、隔离和淘汰猪仔。本论文主要针对该试剂盒的原材料、生产工艺及反应体系进行研究。主要内容及结果如下:在试剂盒原材料研究中,对原材料进行比对和优选,分别对三家公司生产的Taq酶、PCR反应缓冲液和UDG酶进行比对试验。在qPCR扩增结果中Takara宝生物工程(上海)有限公司的Taq酶和PCR反应缓冲液的Ct值和荧光增长值最高,扩增效率最好;上海博彩生物科技公司的UDG酶能有效去除污染,且质优价廉;同时为试剂盒制备了参考品,其阳性参考品的Ct值在20-25、最低检测限参考品的Ct值在30-35、精密性参考品的Ct值在20-25、阴性参考品无扩增曲线和Ct值。在试剂盒的生产工艺研究中,对影响生产工艺的因素温度进行了研究,即高浓度样本、中浓度样本和低浓度样本分别在冻融次数、2-8℃、-20℃、-70℃和低温运输时的最适保存期限进行了研究。其中被测中浓度样本于-20℃储存条件下反复冻融其核酸浓度会降低,冻融次数超过5次后荧光增长值会从4.13减弱到1以下,所以建议冻融次数一般不超过5次。同样原理,不同浓度样本在室温下模拟冰袋低温运输0小时(hour,h)、24 h、48、72 h、96 h和120 h后,其核酸浓度会降低,在运输72 h之前的样本的Ct值的CV值都小于5%,而低浓度样本在运输96 h时的Ct值明显滞后,CV值大于5%。因此综合考虑样品在冰袋低温运输不宜超过96 h。不同浓度的样本在2-8℃的存储0天、1天、2天、3天、4天和5天时分别进行核酸提取和qPCR扩增检测,高浓度样本的变异系数都小于5%,中浓度样本在储存第5天时,其变异系数大于5%,低浓度样本第4天时Ct值的变异系数大于5%,因此将3天作为2-8℃存储条件下的样本有效期。不同浓度样本在-20℃存储0天、1个月、2个月、4个月、6个月、8个月、10个月、12个月时分别进行核酸提取和qPCR扩增检测,同理将6个月作为-20℃的保存期限。不同浓度样本在-70℃存储0天、1个月、2个月、4个月、6个月、8个月、10个月、12个月时分别进行核酸提取和qPCR扩增检测,同理将12个月作为-70℃的保存期限。在试剂盒总反应体系分别为12.5μL,25μL和50μL的相关用量试验中,25μL体系和50μL体系结果显示样本均获得较高的荧光信号值,12.5μL的反应体系中灵敏度不高且荧光增长值较低,50μL体系灵敏度高易造成假阳性且耗费试剂多一倍。因此将25μL作为总反应体系。