PD-1（程序性细胞死亡1）作为免疫抑制性受体表达于活化的T、B、NK细胞和巨噬细胞表面。采用抗体阻断PD-1与其配体的结合近年来成为对付癌症非常有效的免疫治疗手段。然而,由于抗体Fc和免疫细胞表面的Fc受体介导的免疫清除效应会严重干扰抗PD-1抗体的治疗效果。因此,发展缺失Fc片段或Fc功能的抗体或抗体片段成为研究方向之一。纳米抗体是源自骆驼重链抗体可变区的单域抗体,不具备Fc片段,作为潜在的PD-1阻断剂具有一定的优势。同时,纳米抗体作为一种小分子抗体可以在原核细胞中高效表达,这为纳米抗体的生产提供了简便和廉价来源。然而,由于纳米抗体具有保守的链间和链内二硫键,需要以可溶形式和还原条件进行表达才能最大程度保持其抗体活性。因此,需要选择合适的表达宿主和表达条件、并选择合适的表达体系以获得活性高和得率好的纳米抗体。另外,为了克服纳米抗体体内给代谢快的缺点,需要采取策略延长其血浆半衰期。本研究主要对课题组前期从PD-1免疫的噬菌体展示文库中筛选出的一株抗PD-1纳米抗体（编号为:C3）开展原核表达及阻断功能分析和延长半衰期的实验工作,以期为今后进一步开展该纳米抗体的抗肿瘤作用提供材料。本研究主要包括以下三部分:1.PD-1纳米抗体C3在大肠杆菌表达条件的分析和优化将抗PD-1纳米抗体（C3）目的片段构建至pET22b-HA和pMECS载体上,并分别转化入BL21、TG1、WK6中得到C3-pET22b-BL21、C3-pMECS-WK6和C3-pMECS-TG1三种表达体系,发现C3-pMECS-WK6表达量居中但可溶性表达量最多,C3-pMECS-WK6和C3-pMECS-TG1的结合活性明显高于C3-pET22b-HA-BL21,因此,为了得到更多有活性的可溶性蛋白,选择C3-pMECS-WK6为最佳表达体系。C3-pMECS-WK6体系下进行蛋白表达,通过超声破碎和高低渗反复冻融法等不同处理方法得到相对单一部位的三种表达蛋白,其中胞间质蛋白的表达量最少,胞质蛋白的表达量最多。经过ELISA分析发现包涵体的结合活性最低,胞质的结合活性最高,但三种蛋白的结合活性相差不大。由于胞间质和胞质表达蛋白都为可溶性蛋白,而包涵体表达需要经过复性才有可能重新获得活性且活性不稳定,故应选择胞质表达得到目的蛋白。C3-pMECS-WK6体系下胞质表达得到目的蛋白,通过比较16℃、28℃和37℃三种表达温度下的表达水平和抗原结合活性发现,16℃的表达量与37℃的表达量不相上下,但1 6℃的可溶性表达量最多且占总表达量的比例最高,三种温度下的C3蛋白与PD-1蛋白都有一定的结合,差异不大。因此选择16℃为抗PD-1纳米抗体（C3）的最适表达温度。2.PD-1纳米抗体C3对PD-1与其配体PD-L1结合的阻断效应分析在最适条件下大量表达抗PD-1纳米抗体C3蛋白,采用ELISA法验证发现,抗PD-1纳米抗体可以有效阻止PD-1和PD-L1蛋白的结合,进而对PD-1/PD-L1通路有明显阻断作用。3.融合抗白蛋白纳米抗体Alb延长PD-1纳米抗体C3体内半衰期的效应成功构建重组质粒C3-Alb-pET22b,并在大肠杆菌中正常表达C3-Alb蛋白,通过SDS-PAGE和ELISA鉴定发现其与PD-1蛋白和HSA蛋白均有一定程度的结合,为后续进行半衰期延长测定实验提供了基础。综上所述,本实验通过比较在大肠杆菌不同表达体系、不同表达部位和不同表达温度下的C3蛋白表达水平和结合活性,最终确定pMECS-WK6体系、胞质表达、16℃为抗PD-1纳米抗体（C3）可溶性蛋白的最佳表达体系、最佳表达部位和最适表达温度。通过对抗PD-1纳米抗体在PD-1和PD-L1蛋白结合中的阻断作用验证,发现其可以有效阻断PD-1/PD-L1通路,为今后纳米抗体的可溶性表达研究和PD-1纳米抗体药物开发提供了表达基础和实验依据。成功构建融合蛋白C3-Alb为以后的抗体研发提供了新途径、新方向,为纳米抗体药物半衰期的延长提供新思路和实验积累,并为后期的新药生产提供研究基础。