HSV-1和VSV感染对树突状细胞中TRPV2通道功能的调节作用研究

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树突状细胞(dendritic cells,DCs)作为机体内功能最强的抗原提呈细胞(antigen presenting cells,APCs),是连接天然免疫反应和适应性免疫反应的桥梁,被称为免疫应答的中心。通过分析骨髓来源的树突状细胞的RNA-seq数据库,我们发现树突状细胞中高丰度表达TRPV2(transient receptor potential vanilloid 2)通道,TRPV2通道是属于TRPV通道家族的一类非选择性阳离子通道,它们广泛表达在多种组织和细胞中并参与多种重要的生理活动,如表达在巨噬细胞中的TRPV2通道在早期吞噬过程中发挥关键性作用。为了探究树突状细胞中TRPV2通道的功能,我们首先建立了体外诱导分化树突状细胞的体系:取6-8周龄C57小鼠的骨髓细胞(bone marrow),在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)刺激下诱导其向树突状细胞分化,通过普通显微镜观察细胞形态以及流式细胞仪检测细胞表面特异性的蛋白质分子,分析树突状细胞的成熟状态;并开展了病毒(水疱性口炎病毒和Ⅰ型单纯疱疹病毒)感染树突状细胞的实验,得到如下研究结果:(1)TRPV2通道在成熟的树突状细胞中高丰度表达。实时荧光定量PCR(RT-PCR)和蛋白免疫印迹等实验结果表明TRPV2通道在树突状细胞中有高表达;进一步通过全细胞膜片钳技术,记录树突状细胞中TRPV2的通道电流,发现树突状细胞中的TRPV2通道具有较好的电流活性。(2)TRPV2通道的表达水平及离子通道活性随着树突状细胞的分化成熟而上调。通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)、蛋白免疫印迹实验和全细胞膜片钳实验,检测处于不同分化阶段的树突状细胞中TRPV2通道的表达及电流活性,结果显示随着树突状细胞的分化成熟,TRPV2通道的表达及电流活性均呈上调趋势。(3)病毒刺激树突状细胞后TRPV2通道的表达水平及通道活性发生显著变化。本课题选用水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)和Ⅰ型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus 1,HSV-1)两种病毒分别刺激树突状细胞,刺激时间为0、4、8、12 h,结果表明随着病毒刺激时间的增长,TRPV2通道的表达水平呈现出先下降后上升的趋势;全细胞膜片钳实验结果表明,病毒刺激树突状细胞后,TRPV2通道对激动剂2-APB的敏感性增强。(4)Trpv2通道基因被敲除后不影响树突状细胞的分化成熟。敲除树突状细胞中的Trpv2基因后,通过流式细胞术对树突状细胞的分化情况进行跟踪检测,结果显示TRPV2通道的缺失不影响树突状细胞的成熟。(5)下调树突状细胞中TRPV2通道的表达水平后,病毒感染量上调。病毒感染TRPV2通道表达水平被下调的树突状细胞,通过流式细胞术和实时荧光定量PCR检测病毒感染量,发现下调TRPV2通道的表达后,病毒感染量增多。本论文针对树突状细胞中TRPV2通道的功能研究,实验结果表明TRPV2通道在树突状细胞中高表达且有较好的离子通道活性;病毒刺激树突状细胞后,TRPV2通道的表达水平和离子通道活性均发生显著变化;虽然敲除Trpv2通道基因后不影响树突状细胞的发育成熟,但是敲低树突状细胞中TRPV2通道的表达水平,可上调病毒对树突状细胞的感染量。我们的研究取得了阶段性的结果,为后续深入探讨TRPV2通道在树突状细胞中的功能以及其它离子通道在免疫系统中的功能研究打下了良好的基础。
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