论文部分内容阅读
大豆疫霉(Phytophthora sojae)侵染大豆(Glycine max)引起的疫霉根腐病是威胁全世界大豆生产的毁灭性病害之一，大豆和大豆疫霉的互作符合基因对基因学说，合理利用大豆的抗病基因是控制大豆疫病的最有效的措施，因此，研究大豆的抗性基因和大豆疫霉的无毒基因在分子水平上的互作机理是解释病害发生机制和开发病害控制措施的根本途径。但是，由于疫霉基因组较大，结构复杂，且疫霉遗传转化体系建立困难重重，疫霉无毒基因的标记和克隆工作进展十分缓慢，目前已报道的疫霉无毒基因仅有三例.本研究未采用传统的无毒基因克隆策略，而是充分发挥新兴的生物信息学技术优势，通过对无毒基因的基因组结构进行分析，在国际上首次发现了无毒基因在基因组上呈多拷贝的重要基因组特征，并且利用这一特征迅速筛选到一批候选无毒基因，结合大豆疫霉菌的遗传学和分子生物学研究手段，从其中克隆了无毒基因Avr3c，定位了无毒基因Avr5，为进一步认识大豆疫病的致病分子机理和开发该病害的防治措施提供了理论和实践意义，更重要的是，本研究开辟的一套克隆疫霉无毒基因的全新方法，对克隆更多的疫霉无毒基因具有指导作用，对其它病原物的无毒基因克隆工作亦具有重要的借鉴和参考价值。
研究大豆的抗性基因和大豆疫霉的无毒基因在分子水平上的互作机理是解释病害发生机制和控制病害发生的根本方法。综合利用生物信息学、测序、Southern blotting和Real time PCR等技术对不同菌株中的Avr3a的基因组结构进行了深入研究，发现Avr3a在含有Avr3a-1序列的无毒菌株(R2、R1、R3、R8、R9、Rl0、R11、R16和R25)基因组中有4个完全一致的拷贝，但在含有Avr3a-3序列的无毒菌株(R12、R19和R20)中却只有1个拷贝，在含有Avr3a-2序列的毒性菌株(R6、R7、R17、R21和R24)中也只有1个拷贝，无毒菌株R2的4个Avr3a拷贝并非呈簇状简单的排列在基因组上，而是分别座落在4个序列几乎完全一致的10.8 kb重复片段上，每一个片段被预测含有5个Open Reading Frame(ORF)。Avr3a无毒片段在橡树疫霉(p.ramorum)和致病疫霉(p.infestans)中的剧烈变化，揭示该无毒片段在进化中经历了复杂的演变。迄今，已克隆的无毒基因PrAvr3a，PsAvr3a，PsAvrla和PsAvr1b均为在无毒菌株中存在多拷贝的RXLR基因，针对该特征，利用depth sampling方法在大豆疫霉全基因组中找到了70个可能含有多拷贝的RXLR基因，这些基因是大豆疫霉无毒基因的重要候选基因。以上研究对进一步认识无毒基因的特征，鉴定和克隆更多的无毒基因，并最终揭示大豆疫霉的致病分子机理具有理论和实践意义。
对已克隆的无毒基因Avrlb，Avrla和Avr3a的研究发现卵菌无毒基因可能具有共同的特征：含有信号肽和RXLR motif，大多座落在基因组的连续复制大片段上，同时大豆疫霉无毒基因在侵染大豆的24小时和48小时中也是有规律可循的。因此借助depth sampling和Microarray分析手段，本文迅速缩小了无毒基因的范围。453个预测含有RXLR motif的ORF被进行了depth sampling分析，发现了70个trace file value>35(两个以上拷贝)的ORF。利用nucroarray技术对107个在affymetrix clups上的RXLR基因的高通量表达分析，57个在侵染24h，48h和游动孢子萌发阶段高量表达的基因被鉴定。Depth sampling和Microarray的分析结果交互后确定9个基因和已知的无毒基因具有类似的基因组结构和转录特征，其中之一为Avh27.已有的遗传图谱显示该基因座落在Avr3c区域内.该基因在基因组上有3个paralog(2个Avh27a和1个Avh27b)，均位于33kb左右的重复大片段内.来自无毒菌株R2的Avh27a全长或不含信号肽基因都可以诱导抗性基因Rps3c介导的大豆细胞死亡，Avh27b全长或不含信号肽基因均不能诱导死亡，说明Avh27a可能是无毒基因Avr3c。RT-PCR结果显示Avh27a在所有菌株中表现出一致的转录特征：接种后24h高量转录，却在接种后48h均不转录。CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)标记在F2的后代中的检测发现Avh27a和Avr3c的毒性表型完全连锁。同时Avh27a在不同菌株内有4种alleles编码3种不同的氨基酸序列，不同菌株中Avr3c序列的多态性和其在Rps3c大豆叶片上引发细胞死亡的能力以及该菌株的在Rps3c大豆叶片上的毒性也是完全一致的.以上结果证明Avh27a就是大豆疫霉无毒基因Avr3c。
传统的遗传标记结果显示大豆疫霉的两个无毒基因Avr3a和Avr5为紧密连锁。最近发现p.sojae的无毒基因Avr1b，Avr1a，Avr3a和p.infestans的Avr3a在基因结构上均具有信号肽和RXLR定位信号.因此推断无毒基因Avr5可能为一个或一组座落于Avr3a区域附近的含信号肽序列的RXLR基因.生物信息学技术扫描已克隆的Avr3a附近的1 Mb区域得到了23个编码RXLR分泌蛋白的阅读框Open Reading Frame(ORF)。采用Microarray和半定量RT-PCR技术检测候选ORF在毒性菌株和无毒菌株中的转录差异，并对所有的ORF进行了测序，比较了毒性菌株和无毒菌株间的序列差异。利用大规模测序获得的12个Cleaved Amplified Polymorphic Sequence(CPAS)标记在120个F2后代中对Avr5进行了精细作图。作图结果将Avr5定位在一个77.7 kb的区域内，该区域含有Avr3a，Avh36和Avh38等3个RXLR基因。RT-PCR、测序以及基因枪的结果显示Avh36和Avh38不是Avr5。进一步根据基因组结构、菌株基因组RFLP、以及序列多态性综合分析推测Avr5可能就是Avr3a-1.
本文从无毒基因Avr3a的基因组特征入手，发现了无毒基因在基因组上多存在多拷贝的特征，这是一个尚未报道的无毒基因新特征。根据这一重要线索，结合传统的遗传标记和高通量的Microarray等技术手段，迅速克隆了无毒基因Avr3a，定位了无毒基因Avr5。完成了实践总结理论，再由理论指导实践的科学认知过程，开辟了一条快速克隆无毒基因的新策略，对其它病原菌的无毒基因克隆工作也提供了重要的参考价值。