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端粒(Telomeres)是线状染色体末端的特殊的重复DNA序列,在高分化的正常人体细胞中,它的长度随着细胞的分裂而逐渐缩短。端粒的长度可以反映细胞的复制史及其复制潜能。端粒酶(Telomerase)是细胞中负责延长端粒的一种酶,除了干细胞、生殖细胞和其他具有高度增殖能力的细胞外,在正常细胞中很少表达。细胞中端粒酶的高表达可以维持端粒的长度从而使细胞获得永生化。端粒酶由人端粒酶RNA成分(hTR),人端粒酶相关蛋白(hTP)和人端粒酶逆转录酶(hTERT),且hTERT mRNA的表达水平与端粒酶的活性呈正相关。相关研究已经表明,hTERT在肿瘤的免疫治疗领域有着很好的应用前景。目的:本课题拟构建hTERT基因哺乳动物表达载体pCI-neo-hTERT,并观察其在人类白血病细胞系K562中的表达,为进一步探讨hTERT在骨肿瘤方面的应用提供实验基础。方法:一、重组质粒的构建及鉴定从人骨肉瘤细胞系HOS中提取总RNA,并逆转录成cDNA;对逆转录获得cDNA行PCR以获得目的片段,电泳位置合适后切胶回收以纯化基因。将目的基因片段及pCI-neo载体质粒通过Not I、EcoR I双重酶切后,连接到一起,并转化到大肠埃希氏菌DH5α中。挑选出单克隆菌株,并进行菌液、重组质粒的PCR鉴定。选取经鉴定含有目的基因的质粒,行DNA测序分析,并将结果与目的基因序列进行BLAST比对,以验证质粒中是否已正确插入hTERT基因。二、重组质粒的表达鉴定将重组并鉴定后无误的质粒通过电转的方式转染到K562细胞中,并用G418筛选,获得稳定表达的单克隆细胞株。通过实时荧光定量PCR技术,比较转染后细胞与转染前细胞hTERT的表达水平。三、hTERT对于细胞增殖的影响选取高表达hTERT的转染后细胞株,利用流式细胞术,检测转染前后细胞增殖能力的改变。结果:1、成功构建了pCI-neo-hTERT哺乳动物表达质粒。2、成功获得过表达hTERT基因的K562细胞株,实时荧光定量PCR结果显示,转染后的细胞hTERT表达水平较转染前明显升高。3、转染前后,细胞的增殖能力未发生明显的改变。结论:pCI-neo-hTERT哺乳动物表达质粒已成功构建且其在K562细胞内可正常表达为后续研究hTERT基因在骨肿瘤方面的应用提供了实验工具。