米糠油具有高营养价值,经常食用可降血脂、降胆固醇、调节人体血脂代谢、改善心脑血管疾病、抗氧化、抗癌等,有着广阔的消费前景,这是由于米糠油中富含生物活性成分,尤其是富含油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸,因此,本论文研究了米糠油主要不饱和脂肪酸对肝癌细胞HepG2的凋亡诱导作用并初步分析了其抗癌作用机理。本研究采用MTT法测定了人肝癌细胞HepG2及人正常肝细胞HL-7702的生长曲线;采用HE染色及Hoechst染色法利用光镜及荧光显微镜观察了 HepG2及HL-7702细胞处理前后增殖形态的变化;采用细胞划痕实验及Transwell小室侵袭实验测定了米糠油不饱和脂肪酸对HepG2细胞迁移及侵袭能力的影响。MTT实验结果显示:米糠油不饱和脂肪酸在一定浓度范围内对肝癌细胞有明显的生长抑制作用,当米糠油浓度达到0.25 mmol/L、油酸0.2 mmol/L、亚油酸0.1 mmol/L以上时,抑制作用明显,而米糠油不饱和脂肪酸对正常肝细胞无明显抑制作用;光镜及荧光显微镜观测结果显示:经米糠油不饱和脂肪酸处理后的肝癌细胞明显收缩变圆,胞体变小,细胞间隙增大,胞核模糊不清,部分细胞出现脱落现象,核仁外溢现象,而正常肝细胞无明显生长抑制形态;划痕实验结果显示:米糠油不饱和脂肪酸可以不同程度抑制HepG2细胞的迁移能力,其迁移抑制率可达到15%左右;侵袭实验结果显示:米糠油不饱和脂肪酸可以不同程度抑制HepG2细胞的侵袭迁移能力,其侵袭抑制率可达50%左右。说明米糠油不饱和脂肪酸对正常肝细胞无明显增殖抑制作用,而对肝癌细胞则具有明显增殖抑制作用。以正常肝细胞作对比,严格说明米糠油不饱和脂肪酸特异性抑制肝癌细胞生长的实效性,为米糠油不饱和脂肪酸的开发利用奠定了基础。在上述研究的基础上,为了探讨米糠油不饱和脂肪酸对肝癌细胞生长增殖抑制的原因,本研究进一步采用流式细胞术检测了米糠油不饱和脂肪酸处理前后肝癌细胞HepG2凋亡情况及周期分布的变化;采用Western blot检测了处理前后肝癌细胞HepG2的凋亡标志因子Caspase-3的表达量变化;采用流式细胞术检测了处理前后经罗丹明123染色后肝癌细胞HepG2线粒体膜电位的变化。流式凋亡检测结果显示:米糠油不饱和脂肪酸处理肝癌细胞HepG2后的凋亡率分别达到:米糠油组31.5%、油酸组48.9%、亚油酸组37.5%,凋亡率显著上升;细胞周期分布检测结果显示:米糠油不饱和脂肪酸可使肝癌细胞出现明显的凋亡峰,而非引起细胞周期阻滞达到生长抑制的效果;Western blot分析结果显示:米糠油不饱和脂肪酸处理后肝癌细胞全蛋白中Caspase-3蛋白的表达量显著上调;线粒体膜电位检测结果显示:米糠油不饱和脂肪酸处理后肝癌细胞的线粒体膜电位缺失明显。说明米糠油不饱和脂肪酸可使肝癌细胞发生凋亡诱导作用从而抑制其生长增殖。在上述研究的基础上,为了进一步探究米糠油不饱和脂肪酸对肝癌细胞凋亡诱导的作用机理,本研究采用Western blot检测内质网应激相关蛋白 GRP78、CHOP及凋亡Caspase级联蛋白Caspase-12在米糠油不饱和脂肪酸处理肝癌细胞HepG2前后随时间变化的表达量变化;采用Western blot检测凋亡标志蛋白Bax及Bcl-2在米糠油不饱和脂肪酸处理肝癌细胞HepG2前后的表达量变化。从内质网应激通路初步表明了米糠油不饱和脂肪酸是通过引起内质网应激起始蛋白GRP78在处理后6h表达上调,持续应激进而诱导内质网应激凋亡起始蛋白CHOP在12 h后表达上调,最终诱导Caspase凋亡级联蛋白Caspase-12在24 h后表达上调,引起细胞凋亡。以此研究米糠油不饱和脂肪酸促使肝癌细胞凋亡的作用效果,以及米糠油不饱和脂肪酸对肝癌细胞凋亡的作用机理。综上所述,米糠油不饱和脂肪酸在体外对肝癌细胞HepG2有显著的凋亡诱导作用,而对正常肝细胞HL-7702无影响,并能有效降低肝癌细胞HepG2的迁移和侵袭能力,机制分析结果帮助我们推测米糠油不饱和脂肪酸可通过激活内质网应激相关途径,从而诱导HepG2发生凋亡。这将为米糠油的进一步开发利用提供研究基础,并为寻找和开发一种新型的天然抗癌活性物质提供参考依据,同时也为米糠油不饱和脂肪酸在食品及医药方面的应用研究提供理论基础。