论文部分内容阅读
自闭症谱系障碍（Autism spectrum disorder,ASD）是一组起病于儿童生命早期,且伴随终身的神经发育障碍疾病,其男性患病率明显高于女性。ASD的核心症状包括:社交障碍（包含语言和非语言交流障碍）、兴趣狭窄和受限的、重复的行为。在过去的几十年中,ASD的患病率急剧上升,研究显示,美国儿童ASD患病率约为1.9%,全世界也有超过1%的人被诊断为ASD。因对ASD的发病机制知之甚少,且缺乏靶向治疗,ASD的社会成本日益增加,已成为全球性的公共问题。在哺乳动物中,前额叶皮层（Prefrontal cortex,PFC）是高级认知和社会功能的关键部位,在决策、情绪调节、注意力控制和工作记忆中起着重要作用,其动态变化与ASD的社会功能缺陷有关。ASD的病因包含遗传、免疫和环境因素,大多数ASD病例中遗传因素起着重要作用。研究显示,许多与ASD相关的基因突变会引起树突分枝减少、树突棘密度异常和形态缺陷,并在不同水平影响突触可塑性。研究表明,异常的神经元突触和树突棘形成参与ASD的发病机制。CTNND2基因位于人染色体5p15.2上,位于小鼠染色体15 B2上,其编码的蛋白δ-连环蛋白（δ-catenin）属于p-120连环蛋白（p120-catenin,p120ctn）家族成员之一,主要在大脑皮层和海马神经元中表达。δ-catenin蛋白水平在小鼠胚胎期第13天开始上升,出生后第7天达到最高,成年时则下降到一定水平,且多分布在树突。δ-catenin对于成熟皮层树突和树突棘的维持至关重要。课题组前期已经成功建立CTNND2基因缺失小鼠模型,并证实该小鼠存在ASD样行为。褪黑素（Melatonin,MT）是松果体分泌的主要激素,具有神经保护和调节昼夜节律的作用。研究发现,MT能改善ASD患者行为学异常,但MT影响ASD核心症状的具体机制,则少有报道。第一部分观察CTNND2缺失小鼠ASD样行为及树突棘改变目的:验证CTNND2基因缺失(CTNND2-/-)小鼠具有ASD样行为,观察其PFC神经元树突棘发育是否受损。方法:1.采用聚合酶链式反应（PCR）检测小鼠的基因型。2.分组:CTNND2-/-组和野生型（WT）对照组。3.行为学检测:三箱社交试验（PN50d）、青年玩耍试验（PN52d）、旷场试验（PN54d）。4.高尔基染色（PN56d）:分析PFC神经元的树突棘密度和面积。结果:1.行为学检测结果（1）三箱社交试验中,与WT对照小鼠相比,在社会互动测试阶段,CTNND2-/-小鼠嗅触陌生鼠1的时间减少,在中间腔室停留的时间增加;在新事物偏好测试阶段,CTNND2-/-小鼠嗅触陌生鼠2的时间减少。（2）青年玩耍试验中,与WT对照小鼠相比,CTNND2-/-小鼠社交互动时间减少。（3）旷场试验中,与WT对照小鼠相比,CTNND2-/-小鼠的总跨格数、跨中央格数、直立数和攀墙数减少,发生自我捋毛行为的时间增加。2.高尔基染色结果:与WT对照小鼠相比,CTNND2-/-小鼠总树突棘密度、蘑菇状树突棘和短粗状树突棘的密度降低,同时蘑菇状树突棘和短粗状树突棘的面积减少,而丝状树突棘的密度和面积无明显变化。结论:CTNND2-/-小鼠具有ASD样行为,可作为ASD小鼠模型,其PFC神经元树突棘发育受损。第二部分MT对CTNND2缺失小鼠ASD核心症状的改善目的:探究MT能否改善CTNND2-/-小鼠ASD核心症状,并为后续实验选出改善效果最明显的剂量。方法:1.采用聚合酶链式反应（PCR）检测小鼠的基因型。2.分组:CTNND2-/-组、野生型（WT）对照组、CTNND2-/-+5mg/kg MT（5mg/kg MT）组、CTNND2-/-+10mg/kg MT（10mg/kg MT）组和CTNND2-/-+50mg/kg MT（50mg/kg MT）组。3.MT干预:从PN22d开始,连续28天以0.01ml/g体重进行MT灌胃给药。4.行为学检测:三箱社交试验（PN50d）、青年玩耍试验（PN52d）、旷场试验（PN54d）。结果:1.行为学检测结果（1）三箱社交试验中,与CTNND2-/-小鼠相比,在社会互动测试阶段,三种剂量MT组小鼠嗅触陌生鼠1的时间增加,5mg/kg MT组和50mg/kg MT组在中间腔室停留的时间减少;在新事物偏好测试阶段,10mg/kg MT组嗅触陌生鼠2的时间增加,5mg/kg MT组仅在中间腔室停留的时间减少。（2）青年玩耍试验中,与CTNND2-/-小鼠相比,5mg/kg MT组和10mg/kg MT组社交互动时间增加。（3）旷场试验中,与CTNND2-/-小鼠相比,10mg/kg MT组的总跨格数和跨中央格数增加,50mg/kg MT组的总跨格数增加。三种剂量MT组小鼠发生自我捋毛行为的时间减少。结论:三种剂量MT能不同程度地改善CTNND2-/-小鼠的ASD样行为,以10mg/kg MT效果最佳,后续实验中,选用该组小鼠进行研究。第三部分MT改善CTNND2缺失小鼠ASD核心症状的相关机制目的:观察MT能否通过上调CTNND2-/-小鼠前额叶皮层PI3K/Akt/m TOR信号通路蛋白表达,促进突触相关蛋白合成并改善树突棘发育,初步探讨MT改善ASD异常行为学的可能机制。方法:1.分组:CTNND2-/-组、野生型（WT）对照组、CTNND2-/-+10mg/kg MT（10mg/kg MT）组、CTNND2-/-+DMSO组、CTNND2-/-+MT组和CTNND2-/-+Wortmannin+MT组。2.脑立体定位注射（PN56d）:前额叶皮层分别注射5%DMSO、MT和Wortmannin。3.免疫印迹法检测（PN56d）前额叶皮层p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-m TOR和m TOR蛋白表达情况。4.免疫印迹法检测（PN56d）前额叶皮层p-Syn、Syn、ELKS和PSD95蛋白表达情况。5.高尔基染色（PN56d）:分析PFC神经元的树突棘密度和面积。结果:1.与WT对照小鼠相比,CTNND2-/-小鼠前额叶皮层p-PI3K/PI3K、p-Akt（Ser473）/Akt、p-Akt（Thr308）/Akt和p-m TOR/m TOR的比值减小;与CTNND2-/-小鼠相比,10mg/kg MT组前额叶皮层p-PI3K/PI3K、p-Akt（Ser473）/Akt、p-Akt（Thr308）/Akt和p-m TOR/m TOR的比值增大。2.与WT对照小鼠相比,CTNND2-/-小鼠前额叶皮层p-Syn/Syn的比值以及ELKS和PSD95表达下降;与CTNND2-/-小鼠相比,10mg/kg MT组前额叶皮层p-Syn/Syn的比值以及ELKS和PSD95表达升高。3.高尔基染色结果:与CTNND2-/-小鼠相比,10mg/kg MT组的总树突棘密度、蘑菇状树突棘和短粗状树突棘的密度升高,蘑菇状树突棘和短粗状树突棘的面积增加,而丝状树突棘的密度和面积无明显变化。4.在CTNND2-/-小鼠PFC注射MT以及Wortmannin,MT对PI3K/Akt/m TOR信号通路的激活作用能被Wortmannin抑制,同时MT促进突触相关蛋白合成的作用也能被Wortmannin抑制。结论:MT可能通过上调CTNND2-/-小鼠前额叶皮层PI3K/Akt/m TOR信号通路蛋白表达,促进突触相关蛋白合成并改善树突棘发育。