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P-gp（Permeablity Glycoprotein）是由MDR1（multidrug resistance 1）基因编码的一种位于胞质膜上的外排蛋白,在体内主要分布于脑内毛细血管内皮细胞、肠道柱状上皮细胞等,与底物结合后将其从细胞浆中排出细胞,脑毛细血管内皮细胞上高表达的P-gp,在限制外源性物质入脑,维持脑内环境的稳定性方面发挥重要作用。特色珍稀傣药龙血竭是从剑叶龙血树中提取得到的一种红色树脂,具有活血化瘀的作用,对模拟微重力效应下神经系统损伤也有保护作用,临床上也可治疗缺血性脑卒中。但其在脑内药效成分浓度很低,治疗剂量偏大,或与其较难通过血脑屏障有关。龙血竭富含黄酮类化合物,其中二氢黄酮类化合物龙血素A（LA）、龙血素B（LB）、龙血素C（LC）是其发挥活血化瘀作用的主要有效成分。前期研究已证明LA、LB、LC是P-gp的底物,血脑屏障中P-gp的外排作用限制了这类活性成分的脑内浓度,因此提高LA、LB、LC在脑内的含量,成为龙血竭发挥神经系统保护作用的瓶颈问题。核酸适配体是近年出现的一种新兴识别分子,靶标广泛、特异性强、亲和力高,已被广泛应用到生物靶标蛋白定量检测、分析成像、药物靶向转运等领域。基于多年龙血竭研究中的难点问题,本课题利用指数富集配基的系统进化技术（SELEX）,首次筛选P-gp的特异性核酸适配体（Apt）,并构建核酸适配体-药物、核酸适配体-P-gp的相互作用体系,利用区带毛细管电泳技术,表征了相互作用体系中的总亲和力,求算了药物LA-Apt、LB-Apt、Apt-P-gp的结合常数。本文主要得到以下研究成果:1)建立了基于磁珠与SELEX技术的Apt筛选方法利用磁珠SELEX技术,筛选得到了14条长度为81 bp的P-gp特异性核酸适配体,分别命名为Apt1号至Apt14号。通过ELISA测定比较了Apt与P-gp、卵清蛋白、牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin,BSA）三种蛋白之间的相对亲和力,发现核酸适配体与P-gp-间的结合作用远远高于卵清蛋白和BSA,表明筛选得到的Apt对P-gp具有特异性。一级序列结构分析发现,它们存在部分相似的碱基序列,如TTTTCC、CCCCC,TGGG等。对其二级空间结构模拟分析发现,筛得的核酸适配体富含凸环结构域,这些特定碱基序列、凸环结构域,或与核酸适配体能特异性结合靶标蛋白P-gp密切相关。2)测定了P-gp与Apt的解离常数,表征了Apt与P-gp的亲和力采用ELISA方法测定了14条核酸适配体的解离常数Kd,从Apt1到Apt14分别为28.56、60.87、75.11、380.5、49.82、17.46、318.2、694.3、50.52、60.01、25.15、116.7、71.50、55.92 nM。其中Apt6解离常数为17.46 nM,解离常数最低表明其与P-gp的亲和性最高。亲和性较高的Apt6和Apt1中富含G、C碱基,表明碱基序列里GC含量高低显著影响P-gp与核酸适配体的亲和性。选择高特异性和高亲和性的Apt6号进行后续药物、蛋白、核酸适配体间的相互作用研究。3)表征了Apt-药物、Apt-P-gp间的相互作用强弱构建核酸适配体-药物、核酸适配体-靶蛋白的相互作用体系,采用毛细管区带电泳技术测定了Apt6-P-gp、Apt6-LA、Apt6-LB、Apt6-LC共四个体系的亲和力,测得Apt6与P-gp间的亲和力nK为3.07×106 M-1。Apt6与LB、LC间的结合常数分别为2.90×105 M-1、3.19×105 M-1,与LA之间未表现出结合。核酸适配体与蛋白间的结合常数,明显高于适配体与LC、LB间的结合常数,说明核酸适配体与P-gp蛋白间的亲和力,远高于核酸适配体与龙血竭药效分子间的亲和力。LC-Apt6间结合常数大于LB-Apt6间结合常数,而LA-Apt6没有结合,说明化学结构的差异显著影响药物分子与核酸适配体的结合。本文首次筛选了P-gp的核酸适配体,其可作为特异性靶向体内P-gp的识别分子。核酸适配体和药物分子之间的结合能力较强,预示着核酸适配体或可作为靶向转运药物的工具分子。核酸适配体易于标记,亦可作为药物体内分布的成像分子。该研究结果或为中药分子体内靶向转运、靶点识别、体内成像等研究,提供基础研究数据。