【摘 要】
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新城疫（Newcastle disease,ND）是一种禽类的高致病性的家禽疾病,由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起。ND因其与之相关的巨大的死亡率和发病率而具有重要的经济意义,被国际兽疫局（OIE）确认为除禽流感之外的另一种A类禽病。因此,有必要加强NDV的诊断和监测。除了经典的病毒分离鉴定外,NDV的检测方法还包括血凝试验（HA）、血凝抑制试验（HI）、
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新城疫（Newcastle disease,ND）是一种禽类的高致病性的家禽疾病,由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起。ND因其与之相关的巨大的死亡率和发病率而具有重要的经济意义,被国际兽疫局（OIE）确认为除禽流感之外的另一种A类禽病。因此,有必要加强NDV的诊断和监测。除了经典的病毒分离鉴定外,NDV的检测方法还包括血凝试验（HA）、血凝抑制试验（HI）、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和酶联免疫吸附试验（ELISA）等。ELISA方法是目前研究较多、进展较快的技术之一,形式多样的ELISA方法广泛应用于ND抗原和抗体的检测。本研究以p ET-30a为表达载体成功原核表达并纯化NDV NP蛋白,并以其为包被抗原,建立了基于NDV NP（Nucleocapsid protein）蛋白的间接ELISA抗体检测方法,并进一步分析了该方法的敏感性、特异性、重复性以及与HI方法检测临床血清样品的符合率,旨在为该方法的临床应用提供试验依据。1、新城疫病毒NP蛋白的原核表达与纯化以新城疫病毒LaSota株基因组为模板,采用RT-PCR方法扩增NP基因,用双酶切线性化表达载体p ET-30a。将NP目的片段和线性化载体片段进行In-Fusion连接转化,获得重组质粒p ET-NP。将酶切和测序正确的重组质粒p ET-NP转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导表达,获得了分子量约为50 k D的重组蛋白。变性后,用His标记的层析镍柱纯化蛋白,SDS-PAGE和Western Blot结果表明,获得了纯度较高、免疫原性较好的NP蛋白。2、新城疫病毒NP蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立以纯化的NDV NP蛋白为包被抗原,优化各项反应条件,建立检测NDV抗体的间接ELISA方法。各项优化结果表明,NP蛋白包被浓度为0.675μg/m L,血清最佳稀释度为1:200,包被条件为4℃过夜,封闭液和样品稀释液均为5%脱脂乳的磷酸盐缓冲液,被检血清稀释度为1:200,血清结合时间30 min,酶标二抗稀释度为1:2500,二抗结合时间为60 min,显色时间为15 min。该方法对H9亚型禽流感病毒（AIV）、J亚群禽白血病病毒（ALV-J）、传染性支气管炎病毒（IBV）、禽大肠杆菌和沙门氏菌阳性血清均无交叉反应发生,特异性良好;其检测灵敏度为血凝抑制试验（HI）的50倍,敏感性良好;组间重复性实验结果表明,变异系数均小于6%,重复性良好。对采集自湖北、山东、河南和江苏养殖场的200份血清样品分别进行ELISA方法和HI抗体检测,符合率为97%。综上所述,本研究通过原核表达纯化的方法,获得了纯化的NDV NP蛋白,将其包被于酶标板,通过优化各项检测条件,建立了基于NDV NP蛋白的间接ELISA抗体检测方法。该方法的敏感性、特异性和重复性良好。对临床样品的检测结果表明,该方法与HI方法符合率高,可用于临床血清样品的NDV抗体检测。
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