人类对龟鳖动物的利用包括多个方面,从古代祭祀器具到作为食物、药物以及观赏动物。市场的需求产生了数量巨大的龟鳖贸易,同时也导致了非法交易的产生。而环境的污染、人类的捕杀、栖息地的侵占和破坏以及外来物种的入侵,使得一些野生龟鳖动物濒危灭绝。市场的大量需求、龟鳖动物高昂的经济价值、野生个体的大量减少以及保护该类动物的迫切要求,促进了龟鳖养殖业的迅速发展,目前已经成为中国水产养殖业的重要部分。长期人工养殖的情况下,连续多年用于繁殖产卵的龟鳖,出现繁殖能力的明显衰退。因此养殖业仍需大量野生个体补充用作繁殖的亲本,以保证满足苗种的需求。为了摆脱人工养殖对野生资源的依赖以及降低对野生群体的需求和破坏,龟鳖动物繁殖性能以及影响因素的研究尤为重要。龟鳖动物生理结构和行为特征有很多相似点,本研究选取了黄喉拟水龟(Mauremys mutica)作为实验对象,筛选了黄喉拟水龟雌雄高繁殖力的个体,研究了多父现象和重复父权现象对群体以及雌雄个体繁殖的影响,通过组织化学技术研究了黄喉拟水龟卵细胞发育的过程,克隆了黄喉拟水龟繁殖相关的基因并筛选了转录组中与雌龟繁殖相关的SNP位点。1.黄喉拟水龟高繁殖力雌性的筛选与研究本实验为了研究黄喉拟水龟的繁殖力并筛选繁殖性能优越的雌龟,利用16对微卫星标记评估了种群遗传结构以及多样性,利用亲子鉴定技术统计养殖群体连续四年的繁殖情况。亲本和子代的遗传多样性差异很小,而每年后代的多样性出现一定的变化。实验分析、统计了 129只亲本以及四年1263只后代的亲权关系,确定了每只雌龟的后代结果以及后代年平均数、后代波动性,并将雌龟分为3种类型(稳定型、波动型和趋平型)。实验成功筛选到7只具有连续高繁殖能力的雌龟,同时也发现两只连续无后代的雌龟。这7只雌龟提供了平均每年16.94%的后代贡献率,这说明龟类可以通过人工筛选得到高繁殖力的雌龟。筛选到的雌龟可用于构建繁殖力优异的种群、开发新的高繁品种,还可为研究雌龟繁殖能力的影响因素提供实验材料。2.黄喉拟水龟卵巢结构及卵子发生过程研究应用组织学方法观察了黄喉拟水龟卵巢与卵子的动态结构变化,探究卵子发生与卵黄形成过程中的形态学特征。结果显示,黄喉拟水龟卵巢实质由周围皮质和中央髓质构成。皮质中分布各个发育阶段的卵泡、闭锁卵泡以及黄体等。卵泡由卵母细胞和周围的单层滤泡细胞组成,外周有卵泡鞘包围。根据黄喉拟水龟卵黄形成的特点将卵子发生过程分为卵黄发生前期和卵黄发生期,又根据滤泡细胞以及透明带等结构的特点将卵子发生细分为10个连续的时期。Ⅰ到Ⅲ期的卵细胞核有明显的灯刷染色体及外周核,卵黄核分布在核侧,之后卵黄核逐渐消失。从第Ⅵ期到第Ⅹ期是卵黄小板逐渐形成的阶段。随着卵黄的发生,卵黄颗粒融合成卵黄小板,卵黄小板的体积随着卵子的发生逐渐增大。卵巢作为卵子发育、成熟、排出的场所,其正常发育保证了生物体正常繁殖的能力。卵泡发育过程中卵母细胞、滤泡细胞、透明带以及闭锁卵泡等形态学特征及其变化过程,不仅对于了解黄喉拟水龟卵泡的发育规律、丰富脊椎动物生殖生物学内容具有重要的理论意义。而且繁殖季节卵巢中卵子数量及发育程度决定了雌性的繁殖情况,卵子发生的研究可从组织学水平辅助研究雌性繁殖能力的差异,对黄喉拟水龟的人工饲养与繁殖、野生资源有效保护以及合理开发利用等也有重要的价值。3.黄喉拟水龟多父现象及父权分配的研究为了研究养殖群体中黄喉拟水龟的繁殖策略,实验分析了 2014年群体中双亲以及所产后代的遗传数据,评估132只亲本138窝302个后代的亲权关系,从而检验黄喉拟水龟中是否存在多父现象及其发生频率。结果显示只在138窝中的7窝后代中发现多父现象,多父频率为5.07%。尽管发生频率低,但是多父现象的观察结果表明黄喉拟水龟和其他淡水龟具有相似的遗传交配策略(一妻多夫)。此外,分析发现在同一个繁殖季节,雌龟连续多窝卵表现为相同的父权,这个现象支持了产卵前交配的精子先被保存,然后被用来为繁殖季的卵受精的假说。实验还统计了群体中各雄龟的后代个数,发现有四只雄龟的后代数大于20个,约占总数的32.78%,这种现象的发生说明每年养殖群体中存在优势个体,但这种优势个体的出现可能会造成群体内遗传多样性的偏移和减少。4.黄喉拟水龟重复父权对雄龟繁殖的影响交配次数被认为是影响一夫多妻制交配策略中雄性繁殖成功的主要因素,雌性繁殖质量的不同也可能会影响雄龟的繁殖成功的变化。我们统计了黄喉拟水龟实验群体4年间雌龟繁殖的变化以及对应的雄龟配偶,发现实验群体的雄龟在四年内都有后代出现,并且每年中存在明显的优势雄龟个体。交配组合的分析显示群体中存在优势基因型组合,他们的后代在雌龟后代中占了重要的部分。当排除只繁殖一年的雌龟,余下的45个多年繁殖的雌龟都出现了父权重复现象。其中40个雌龟(88.89%)为临年重复,5个是隔年重复。在一年内或者相邻几年中,精子储存或重复交配都可能会导致重复父权现象发生。连续多年的重复父权结果说明养殖群体中,黄喉拟水龟由于雌性选择偏好、精子活力差异、固定搭配等因素导致雄龟的繁殖出现了明显的差异,而这种出现优势个体的现象和多父现象分析中雌龟同年连续多窝卵表现相同父权的结果一致。实验结果说明根据雌龟的偏好以及重复父权的差异可以筛选得到群体中的优势雄龟用于繁殖,可以结合高产的雌龟用于迅速扩大群体数量。5.繁殖相关基因FSH β的cDNA、DNA全序列克隆、SNP位点分析为了更方便、准确的筛选到高繁殖力的雌龟,利用候选基因法,进行相关分子标记的筛选。促卵泡激素(FSH)是繁殖过程中重要蛋白,促卵泡激素β亚基(FSH β)是FSH中决定生物功能的关键的亚基。在许多物种研究中发现FSH β基因和繁殖有密切的关系,但黄喉拟水龟没有相关的研究。实验通过RACE技术获得了黄喉拟水龟FSH β基因cDNA的全长(745 bp),并结合Genome Walking技术扩得FSHβ基因的DNA全长序列(3344 bp)。利用软件预测了基因的蛋白一级结构,分别拥有131个氨基酸序列,同时预测了蛋白的空间结构,功能位点,亲水性,等电点。然后根据FSHβ基因的DNA序列全长设计了扩增引物,并利用实验种群的79个雌龟个体的DNA筛选基因中存在的多态性位点。结果显示SNP位点F2146和F2362、F1455和F2138都显示完全的连锁现象。将SNP位点和后代数进行相关性分析,发现多态性位点F741表现为显著相关,其中GG/AG基因型对这个性状有显著的正影响。研究结果表明FSHβ基因多态性和后代数有明显的相关性,可以用做黄喉拟水龟潜在的选育标记。6.黄喉拟水龟雌龟后代数相关SNP标记的筛选本研究根据前期黄喉拟水龟脑-性腺的转录组测序得到的大量繁殖相关的SNP标记位点。我们选取了 90个支持度较好、与雌龟繁殖活动相关的SNP位点,用来验证、筛选与雌龟的繁殖力相关的位点。利用iPLEX Gold reagents进行PCR扩增后,利用飞行质谱法(MALDI-TOF mass spectrometry)进行SNP的分型。实验群体的83个雌性个体对SNP位点验证得到64个位点具有多态性。将多态性的SNP位点,与前期统计得到的雌龟年平均繁殖情况关联后得出:RS24的不同基因型在后代数存在显著差异(p<0.05),AA型的后代数平均数(7.75±0.00)比GG型(3.59±2.36)和GA型(3.64±2.27)都高,GG和GA没有显著的差异。RS17的不同基因型在后代数也存在显著差异(p<0.05),杂合型GG型的后代数(7.75±0)比纯合型GG型(3.60±2.42)和AA型(3.60±2.32)都高,GG和AA之间没有显著的差异。RS5只存在两种基因型,杂合型CG(5.88±2.61)与纯合型CC(3.53±2.30)的后代数存在显著性差异。RS 80的AA型(4.63±2.38)和AG型(3.32±2.45)有显著性差异,而AA与GG以及AG与GG(3.50±1.87)之间不存在明显差异。根据分析结果看出SNP位点RS24、RS5、RS17出现了基因型与高繁殖情况紧密联系的现象,RS24的AA型、RS17的GG型、RS5的CG型,这些SNP位点可能与高繁殖性状具有关联性。进一步的验证后,可以尝试将该标记用于实验种群后代的筛选,从而获得具有高繁殖力的子代个体。综上所述,本实验以黄喉拟水龟为主要代表研究了龟鳖动物繁殖相关的特点以及通过亲子鉴定确定实验群体雌雄龟的每年的繁殖情况,从而根据连续4年的繁殖情况定量的确定了雌龟的繁殖力,并筛选得到了具有高繁殖能力的雌龟。结合4年雌龟的数据结果,将前期转录组筛选的SNP位点进行验证,研究了其与繁殖性状的联系,筛选可用的标记。同时实验还克隆研究了繁殖相关的FSH β基因,分析了其结构特点并研究了实验群体中FSH β基因的多态性情况,总结了筛选的SNP位点和繁殖性状的联系。同时依托于黄喉拟水龟的实验群体,研究了多父及重复父权现象的发生,发现雄龟同样具有筛选的潜力。