研究背景及实验目的糖尿病患者冠心病的发病风险较非糖尿病者提高了2-4倍，2/3的糖尿病患者死于冠心病。糖尿病状态下机体内的高血糖、胰岛素抵抗、氧化应激、炎症反应等多种病理因素促进冠状动脉粥样硬化的发生发展，导致冠脉管腔狭窄或阻塞，最终引起心脏的缺血缺氧。作为机体的代偿性反应，缺氧条件下，血管内皮细胞通过分裂、增殖、迁移等过程形成新生血管开放侧支循环以增加缺血区的血液供应，这对于维持心肌细胞功能、减少心力衰竭、心源性猝死等并发症的发生具有重要意义。然而，动物和临床研究均表明，糖尿病或持续高血糖状态明显抑制心肌缺血后新生血管的形成和侧支循环的建立，但具体机制不明。我们认为可能与糖尿病抑制缺血缺氧条件下内皮细胞的血管生成能力有关。晚期糖基化终产物（Advanced glycation end products, AGEs）是机体在持续高血糖状态下，由蛋白质、脂质和核酸经过非酶促的糖基化以及多步的氧化、脱水和分子重排而形生稳定的、不可逆的大分子复合物。AGEs的形成可引起体内多种酶的失活进而导致蛋白质功能的改变，AGEs与其受体的结合还可以激活信号通路产生多种病理反应。糖尿病患者血清及组织中的AGEs水平明显升高。临床研究表明， AGEs的水平与糖尿病大血管和微血管发生病变的风险呈正相关，是糖尿病血管病变的重要致病因素。细胞外信号调节激酶5(Extracellular signal regulated kinase5，ERK5)是丝裂原活化的蛋白激酶（MAPK）家族成员之一，可被多种胞外刺激（如低氧、高渗溶液、血流剪切力等）所激活发生磷酸化。有研究证实ERK5可对VEGF起到一定调控作用。因此，本实验旨在研究AGEs对缺氧状态下心肌内皮细胞血管生成能力的影响，并以ERK5为切入点探讨其可能机制。实验方法实验一：心肌内皮细胞的分离培养、鉴定及AGEs的制备、含量测定1．采用蛋白酶消化法分离培养SD雄性大鼠心肌内皮细胞，根据组织来源和形态学的特殊性、是否表达Ⅷ因子以及吞噬乙酰化低密度脂蛋白（Dil-AC-LDL)进行细胞鉴定。2．5g BSA、9g D-葡萄糖及10mg青、链霉素溶于100mlPBS中，无菌过滤后分装，置于37℃孵箱中避光孵育90d，孵育结束后采用荧光分光光度法鉴定AGEs并计算其含量。实验二：AGEs对缺氧条件下心肌内皮细胞血管生成能力的影响1．实验分组：对照组：培养液，95%O；AGEs组：AGEs400mg/L，95%O；缺氧组：培养液，5%O；AGEs+缺氧组：AGEs400mg/L95%O，5%O。2．检测指标：MTT比色法检测细胞增殖、Transwell法检测细胞迁移能力、Matrigel实验检测管样结构形成能力、ELISA检测细胞VEGF分泌量。实验三： AGEs对缺氧条件下心肌内皮细胞血管生成能力影响的机制研究1．实验分组：缺氧组：培养液，5%O；AGEs+缺氧组：AGEs400mg/L，5%O；ERK5抑制剂组：AGEs400mg/L，XMD8-925μmol/L，5%O。2．检测指标：Western blot法检测ERK5的表达及ERK5的磷酸化水平，其余检测指标同实验二。实验结果实验一：心肌内皮细胞的分离培养、鉴定及AGEs的制备、含量测定1．酶消化法培养所得心肌内皮细胞：培养至3d时多数细胞形态呈梭形或多角形，部分细胞连接成片，折光性好；7d时细胞铺满培养瓶底，形态学观察呈典型铺路石样生长，铺满培养瓶底部的细胞出现接触抑制现象。培养所得细胞的Ⅷ因子阳性率为92%，95%细胞可吞噬DiL-ac-LDL。2．荧光分光光度计鉴定，所制备AGEs含量为94.7kU/g。实验二：AGEs对缺氧条件下心肌内皮细胞血管生成能力的影响1．与对照组比较，缺氧组细胞的增殖、迁移、管样结构形成能力及VEGF分泌量有所增加（P<0.05）。2．与缺氧组比较，AGEs+缺氧组细胞的增殖、迁移、管样结构形成能力及VEGF分泌量显著降低（P<0.05）。实验三：AGEs对缺氧条件下心肌内皮细胞血管生成能力影响的机制研究1．与缺氧组比较，AGEs+缺氧组ERK5磷酸化水平显著增加，XMD8-92可显著抑制ERK5的磷酸化（P<0.05）。2．与AGEs+缺氧组比较，抑制剂组细胞的增殖、迁移、管样结构形成能力及VEGF分泌均有所增加（P<0.05）。实验结论1．AGEs可抑制缺氧条件下心肌内皮细胞的增殖、迁移、管样结构形成能力及VEGF的分泌；2．AGEs通过增加ERK5的磷酸化抑制缺氧条件下心肌内皮细胞的血管生成能力，其机制可能与ERK5的磷酸化抑制VEGF的表达有关。