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目的:骨肉瘤作为严重危害人类健康的一种恶性肿瘤,患者肿瘤转移早且临床预后差。目前对于骨肉瘤的临床治疗多采取手术治疗、化疗等综合治疗方法,虽然近年来骨肉瘤患者五年生存率较之前有所提高,但是其临床治疗疗效仍不满意。大剂量的化疗可给患者带来严重的副反应以及多药耐药等问题,导致骨肉瘤治疗难以完全治愈。基因治疗作为目前研究的重点,可能给患者带来新的希望,成为未来有效的治疗手段。研究显示,肿瘤细胞恶性增殖、死亡的减少与肿瘤的发生发展具有着密切的联系,同时使细胞耐受放疗、化疗刺激。因此,诱导肿瘤细胞发生死亡成为一种新的肿瘤细胞杀伤治疗策略。miRNA是近些年来发展的一种新的一类非编码小RNA分子,越来越多的研究显示,miRNA参与生物多种重要的生命过程中。miRNA在肿瘤中既可作为癌基因下调抑癌基因的活性,同时也可作为抑癌基因下调原癌基因的活性。自噬性细胞死亡是一种不同于凋亡、不依赖caspase（含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶）的程序性细胞死亡。研究显示,在肿瘤的发生发展中,自噬的抑制发挥着重要作用,沉默自噬基因Beclin1可导致多种恶性肿瘤的发生,因此认为Beclin1是一个候选的肿瘤抑制基因。目前学者研究报道,miR-664在肝癌组织中高表达,且基因芯片技术显示,miR-664在骨肉瘤中异常表达,并经生物学通路分析发现miR-664与Beclin1基因之间存在的较强的相关性。本研究探讨分析miR-664靶向调控Beclin1蛋白在骨肉瘤组织中的表达及对骨肉瘤细胞增殖、侵袭及自噬的影响,从而为骨肉瘤治疗新靶点的发现提供依据。方法:1.选择2013年4月～2015年12月在我院进行外科手术切除的骨肉瘤标本51例,并以阴性的癌旁组织作为对照组,采用q RT-PCR法检测骨肉瘤组织及其癌旁正常组织中miR-664及Beclin1 mRNA表达情况。回顾性分析患者临床病例资料及随访生存情况,分析骨肉瘤组织中miR-664与Beclin1 mRNA表达与患者临床病例资料关系及总体生存时间的影响。2.培养SAOS-2、MG-63细胞,采用荧光素酶报告基因实验检测miR-664与Beclin1之间的靶向关系;向SAOS-2、MG-63细胞中转染miR-664inhibitor、miR-NC,采用CCK-8法检测各组细胞增殖情况,采用流式细胞仪技术检测各组细胞凋亡情况,采用Transwell检测各组细胞迁移情况;采用MDC法分析空白对照组、miR-NC组、miR-664 inhibitor组细胞的荧光强度。结果:1.骨肉瘤组织中miRNA-664相对表达量显著高于癌旁正常组织（P<0.05）,骨肉瘤组织中Beclin1 mRNA相对表达量显著低于癌旁正常组织（P0.05）,而与患者肿瘤Enneking分期、远处转移有关（P0.05）,而与患者肿瘤Enneking分期、远处转移有关（P<0.05）。miR-664低表达患者总体生存率显著优于miR-664高表达患者（P<0.05）。Beclin1 mRNA高表达患者总体生存率显著优于Beclin1mRNA低表达患者（P<0.05）。2.通过Luciferase双荧光素酶报告基因系统检测,发现miR-664 inhibitor的加入能够增强荧光素酶的活性,但对于Mut UTR重组质粒却无明显作用,两组均具有显著的统计学差异（P<0.05）,表明miR-664能与Beclin1基因3′-UTR区种子序列结合并抑制基因表达。3.与miR-NC对照组相比,miR-664下调后,Beclin1基因表达水平明显升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。而在蛋白水平上,与miR-NC对照组相比,miR-664 inhibitor组Beclin1表达水平明显升高。4.CCK-8检测结果显示,检测各组细胞在OD490处的吸光值,在SAOS-2、MG-63细胞内转染miR-664 inhibitor组与miR-NC组及空白对照比较,增殖活力明显降低,差异具有统计学意义（P0.05）。5.采用流式细胞技术检测各组骨肉瘤细胞凋亡情况,其中miR-664inhibitor组细胞凋亡率显著高于空白对照组以及miR-NC组（P0.05）。6.Transwell实验检测miR-664 inhibitor及miR-NC与空白对照组等不同转染组对SAOS-2、MG-63细胞的侵袭能力的影响。miR-NC组与空白对照组组有着类似的SAOS-2、MG-63细胞的迁移数量,miR-664 inhibitor组则显著抑制了SAOS-2、MG-63细胞的侵袭能力,三组之间均表现出明显的统计学差异（P<0.05）。7.采用划痕试验检测骨肉瘤SAOS-2、MG-63细胞迁移能力,空白对照组与miR-NC组细胞具有着相似的迁移能力,而miR-664 inhibitor组细胞迁移能力明显抑制。8.MDC荧光染料作为自噬泡的示踪剂呈绿色点状结构分布于细胞内部,其中空白对照组、miR-NC组的荧光强度相近,表达相对较弱,而miR-664inhibitor组细胞的荧光强度最强。miR-664 inhibitor组荧光强度显著高于空白对照组与miR-NC组,差异具有统计学意义（P0.05）。结论:骨肉瘤组织中miR-664相对表达量显著升高,Beclin1 mRNA相对表达量明显降低,且miR-664、Beclin1 mRNA表达与患者肿瘤分期、转移以及预后有关;miR-664与Beclin 1蛋白之间具有着靶向关系;向骨肉瘤细胞SAOS-2、MG-63转染miR-664 inhibitor,可有效抑制骨肉瘤细胞增殖、促进细胞凋亡、抑制细胞侵袭及迁移,同时可能通过靶向调控自噬基因Beclin1表达而促进肿瘤细胞自噬,进而发挥肿瘤抑制作用,miR-664可作为骨肉瘤治疗的潜在靶点之一。