实验目的：人丝氨酸蛋白酶抑制物KazalⅥ型(SPINK6)是一种功能广泛的蛋白酶抑制剂,本实验室在细小病毒H1的研究中首次发现了其抗肿瘤活性。为进一步开展蛋白水平的研究工作,本实验构建了毕赤酵母外分泌表达系统,通过亲和纯化的方法获得了纯度大于95%的人重组SPINK6蛋白。同时,根据SPINK6蛋白对激肽释放酶14(KLK14)的抑制作用建立其体外活性测定方法。实验方法：根据毕赤酵母密码子偏爱性合成一段编码rhSPINK6蛋白的基因序列,克隆到表达载体pPIC9K中,构建出表达质粒pPIC9K-rhSPINK6,转化至毕赤酵母GS115中进行表达。发酵上清液经阳离子交换树脂Capto MMC初纯后,再以偶联牛胰蛋白酶的Sepharose4B亲和填料进行精纯。根据SPENK6蛋白抑制KLK14活性的特点,建立rhSPINK6的体外活性测定方法。在此基础上,我们将高表达rhSPINK6的菌株接种至75L发酵罐进行大规模培养,并通过离子交换结合凝胶排阻层析的方法进行产品纯化,以获得大量SPINK6蛋白进行后续实验。实验结果：rhSPINK6在毕赤酵母中以外分泌形式表达,表达条件优化后,表达量可达12.5mg/L。经Capto MMC初纯和trypsin-Sepharose4B亲和纯化后,rhPINK6的纯度大于95%,总活性回收率可达43.7%,并可高效抑制KLK14活性(Ki=0.16nM)。在此基础上,我们对rhSPINK6的中试化生产条件进行了摸索,最终,将rhSPINK6表达量提高至50mg/L,纯化产物纯度大于90%,总活性回收率大于40%。结论：通过毕赤酵母系统中成功表达rhSPINK6蛋白,并建立rhSPINK6亲和纯化和体外活性检测方法。在此基础上对中试化生产工艺进行了摸索,为rhSPINK6的成药性研究打下基础。