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目的多西环素(Doxycycline,DOX)是临床上常用的一种四环素类抗生素,近年来它对多种类型肿瘤的抗肿瘤作用受到了较多关注,但DOX对骨髓瘤细胞的影响尚没有相关报道。我们在前期实验中发现,DOX处理人的骨髓瘤细胞株后,在抑制细胞的增殖的过程中存在Akt通路的上调,原因及机制均不明确。本实验一方面研究DOX在不同条件下上调骨髓瘤细胞p-Akt的作用,另一方面研究DOX激活Akt可能的机制以及对Akt通路部分调控基因的影响。方法1、用CCK8法检测不同浓度的DOX(0~40mg/L)处理H929细胞1~3d后对细胞增殖的影响,计算细胞增殖抑制率。用Western Blot法检测不同浓度的DOX(5mg/L和10mg/L)处理H929细胞不同时间点后对p-Akt蛋白表达的影响。2、用Western Blot法检测DOX处理H929细胞后对Akt上游p-PDK1和PTEN蛋白表达的影响。DOX的终浓度为5mg/L,处理时间为3h、6h、10h、1d、2d、3d、+1、+2,+1、+2表示用DOX连续处理细胞3d后换培养液继续培养1d和2d。3、用CCK8法检测PI3K抑制剂Wortmannin(0~2000nmol/L)处理H929细胞1~2d后对细胞增殖的影响,并筛选出合适的抑制剂浓度。用选定的浓度处理H929细胞,Western Blot法检测p-Akt的蛋白表达情况。4、用CCK8法检测两药联合处理对H929细胞增殖的影响,用Western Blot法检测两药联合处理对p-Akt蛋白表达的影响。分为四组:无处理组、5mg/L的DOX培养2d组、无处理培养2d+1000nmol/L的Wortmannin培养4h组、5mg/L的DOX培养2d+1000nmol/L的Wortmannin培养4h组。5、用Western Blot法检测10mg/L的DOX处理H929细胞不同时间后对Akt下游蛋白p-mTOR、p-GSK-3β、p-Bad的影响。用RT-PCR法检测不同浓度的DOX(0~10mg/L)处理H929细胞3d后对Akt下游基因mTOR、Bcl-2、NF-κB的影响。6、用ELISA法检测5mg/L的DOX处理H929细胞不同时间后培养上清液中EGF和IGF-1的变化,时间依次为16h、1d、2d、3d。7、用Western Blot法检测10mg/L的DOX、1000nmol/L的Wortmannin处理H929细胞不同时间后对p-Erk1/2的影响。结果1、不同浓度的DOX处理H929细胞1~3d后抑制细胞增殖,并且随着药物浓度和处理时间增加,抑制率也逐渐增加。不同浓度的DOX处理H929细胞后均能上调p-Akt的表达,时间点有差异,但总体趋势一致。2、5mg/L的DOX处理H929细胞不同时间后,在3h和6h能检测到p-PDK1的上调,其余时间点无变化;PTEN在所有时间点均无变化。3、Wortmannin处理H929细胞1~2d也能抑制细胞增殖,根据实验所需,选用1000nmol/L作为后续实验的浓度。Wortmannin处理H929细胞不同时间后,3h、4h、6h能检测到p-Akt被明显抑制,我们选择4h作为联合处理的时间。4、单独用5mg/L的DOX或1000nmol/L的Wortmannin处理均能抑制H929细胞增殖,两药联合处理后细胞增殖率减低更明显,具有协同作用。单独用5mg/L的DOX处理H929细胞2d检测p-Akt表达上调,单独用1000nmol/L的Wortmannin处理H929细胞4h检测p-Akt表达下调,联合组提示Wortmannin能明显抑制DOX上调p-Akt的作用。5、10mg/L的DOX处理细胞不同时间后,Akt的下游蛋白p-mTOR无明显变化,p-Bad和p-GSK-3β的表达均上调。不同浓度的DOX处理H929细胞3d后,Akt的下游基因mTOR、Bcl-2、NF-κB的mRNA表达水平均下降。6、5mg/L的DOX处理H929细胞不同时间后检测培养上清液中的EGF和IGF-1,EGF的变化无统计学意义,IGF-1的表达较对照组明显升高。7、10mg/L的DOX和1000nmol/L的Wortmannin处理细胞不同时间后,均能下调p-Erk1/2的表达。结论1、DOX抑制了H929细胞的增殖,其抑制作用呈剂量依赖性。2、DOX上调H929细胞p-Akt的的机制,可能与其杀伤细胞过程中导致的细胞应激反应相关。这种上调作用可被PI3K的抑制剂Wortmannin抑制,这提示DOX上调Akt通路的分子机制至少部分是通过PI3K/Akt通路介导的。3、DOX激活Akt后,上调了下游蛋白p-Bad、p-GSK-3β的表达。检测其下游的Bcl-2等基因时发现,mRAN表达下调,这可能与DOX抑制H929细胞作用有关。4、DOX处理H929细胞后上清液中IGF-1的表达增加,可能与DOX刺激H929细胞自分泌IGF-1因子有关。5、DOX处理H929细胞后能抑制其p-Erk1/2的表达,这可能是通过PI3K/Akt通路介导的。