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猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是猪气喘病的主要病原体。该病分布广泛,发病率高,自身致死率不高,但由于Mhp能破坏呼吸道黏膜-纤毛屏障,从而继发其它致病菌的感染,提高致死率。由于早期检测的困难和缺乏有效的药物,在本病控制方面至今未能达到满意的效果。本实验以Mhp168株为材料,研制出其特异性单克隆抗体,并利用该单克隆抗体建立了间接竞争ELISA方法,检测猪肺炎支原体抗体,证明有一定的实用性。实验用KM2培养基(含猪支原体抗体阴性血清)培养Mhp168株,高速离心收集菌体,用PBS悬浮沉淀。悬浮物反复冻融再超声波裂解,用获得的全菌抗原免疫BALB/c小鼠。取脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA和IHA筛选,有限稀释法3次克隆,获得了1株稳定分泌抗Mhp单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为3G5。经亚类鉴定试剂盒测定,所产生的抗体为IgG型;经ELISA方法测定,腹水效价为1:6400;通过Western-blot、间接ELISA和IHA确定,该株单克隆抗体针对Mhp70kD左右的蛋白。单抗经硫酸铵盐析法纯化后,蛋白含量为4.37mg/mL。以Mhp全菌纯化蛋白为包被抗原,利用该单克隆抗体与Mhp猪血清竞争该抗原,建立间接竞争ELISA方法检测Mhp抗体。优化的反应条件为:Mhp蛋白抗原的最佳包被浓度为15μg/mL(1:800稀释);单克隆抗体的工作浓度为10.9μg/mL(1:400稀释);竞争反应作用时间为37℃1h;酶标抗体的工作浓度为1:5000,37℃作用1h;底物作用时间为10min。经ELISA检测,该方法具有较好的特异性、稳定性和重复性。通过检测28份临床病料血清,结果与IDEXX Mhp抗体检测试剂盒的检测结果对比,符合率达到82.1%。从而为Mhp抗体检测提供了一种方便实用的实验室诊断方法,为猪气喘病的控制奠定了基础。