目前,肿瘤治疗中存在的最大问题是药物杀伤肿瘤细胞的特异性不强,经常在杀死肿瘤细胞的同时对正常细胞也造成了致死性的破坏,所以研制靶向性抗肿瘤药物成为当今肿瘤研究领域的热点。由于细胞膜的脂质双分子层结构具有透过选择性,已研究开发的肿瘤单克隆抗体只能与细胞膜表面的特异性表位结合,难以进入细胞内发挥作用。目前普遍采用的辅助手段包括显微注射、脂质体转染、病毒包被等物理和化学方法。虽然上述方法能够将目的分子导入细胞内,但是都不同程度地存在着导入效率低、易造成细胞损伤甚至死亡以及缺少靶向性等缺陷,大大制约了其推广和应用。穿透肽的出现在一定程度上解决了大分子物质跨膜转运的难题。它可以有效的将多肽、亲水性蛋白质分子及DNA片段等大分子物质,导入多种哺乳动物细胞,不仅能够保证活性大分子正常发挥作用,并且在一定浓度范围内不会造成细胞损伤。目前,细胞穿透肽以其独特的内化活性,在细胞生物学、基因治疗、药物体内转运、临床药效评价以及细胞免疫学等研究领域具有诱人的应用前景。穿透肽作为生物活性分子跨膜细胞转运的有效工具,与货物分子的结合可以采取三种不同的方式：①将货物分子即目的基因的cDNA连接于穿透肽基因的N末端,以携带有该融合基因的表达载体转染真核细胞,利用真核细胞自身的蛋白表达系统表达转染的融合蛋白。②利用多肽合成法,将穿透肽与目的多肽、蛋白质等分子体外共价结合,可以获得较高纯度的融合蛋白。③将目的蛋白的cDNA克隆到含穿透肽基因的原核表达载体,通过原核细菌的蛋白表达系统表达融合蛋白。这种方法具有操作简便、实验花费少、融合蛋白转导效率高的优点。除了应用开发研究之外,穿透肽的内化机制成为近几年研究的热点。我们已知极性小分子的跨膜运输是通过转铁蛋白介导的,但是蛋白、核酸、多糖等大分子物质及其他颗粒物质则不能通过该途径进入细胞。上述物质穿透细胞膜以及在细胞内的转运过程是通过形成膜包被小泡的形式来进行的,因此称为囊泡运输,又称为细胞内化。这种运输方式是一种复杂的细胞动力学过程,涉及到多种信号通路的参与,包含了广泛的蛋白与蛋白以及蛋白与脂质、糖类的相互作用。目前发现的大部分穿透肽内化入细胞就是通过囊泡的方式来实现的。但是鉴于技术手段、实验方法的限制和不一,目前对于其内化的具体途径、机制仍不明确。通过本研究,我们淘选得到大量的Hela细胞穿透肽,对其序列进行生物信息学分析,从组学的角度,对穿透肽的序列特点、内化方式进行研究、分类并寻找共性,以期进一步阐明穿透肽的内化机制。噬菌体展示技术是一种用于筛选功能性多肽的生物技术,其原理是将编码多肽的DNA片段与噬菌体衣壳蛋白编码基因进行重组,并以融合蛋白的形式表达在噬菌体的表面。基于生物分子与靶分子(抗体,受体,抗原,酶的底物等)的亲和力,通过吸附-洗脱-扩增的重复过程,将含有能与靶分子特异结合的噬菌体从表达各种外源蛋白的噬菌体库中筛选出来,然后进行富集、扩增及基因序列测定,从而获得外源蛋白的氨基酸组成。该技术将分子结合活性与噬菌体的可扩增性结合在一起,是一种高效的筛选新技术。其优点主要表现在：①外源蛋白或多肽的基因型和表现型统一在同一噬菌体颗粒内,因此通过表型淘选就可以获得它的编码基因。②可以进行高通量筛选,表达偏失低,操作简单。目前已成功应用于抗原表位分析,单抗筛选,蛋白质功能拮抗多肽或模拟多肽的确定,在药物筛选、疫苗设计等方面发挥重要作用。本课题选用的是NewEngland Biolabs公司的Ph.D.-C7C噬菌体展示肽库,它将随机七肽的基因序列插入到噬菌体衣壳蛋白编码基因pⅢ中,使随机七肽对应的表达产物与噬菌体的衣壳蛋白末端形成融合蛋白,从而构建成一个组合文库。此外,在该随机七肽两端各有一个半胱氨酸,它们可以自发的形成一个二硫键,使展示的多肽环化,从而模拟天然多肽的空间构象。基于以上研究背景,本课题设计思路及实验结果如下：实验目的一是利用噬菌体展示技术筛选Hela细胞穿透肽。实验结果显示,经过四轮筛选,内化入细胞的带有穿透肽序列的噬菌体明显富集,回收量逐轮升高,第二、三和四轮筛选后分别较上一轮次富集4.63、10.35和5.53倍。实验目的二是建立Hela细胞的穿透肽库,以期得到大量的确切的穿透肽序列,进行生物信息学分析。实验结果显示经过三轮筛选后,对98个噬菌体的PCR产物进行测序,DHYHPFS、DPYHPFS出现频率分别占测序序列的15%、11%。第四轮筛选后,对49个噬菌体的PCR产物进行测序,DHYHPFS、DPYHPFS出现频率分别占测序序列的51%、33%。根据以上初步测序结果,为了确保穿透肽库的多样性,我们选择第三轮筛选后的噬菌体用于构建穿透肽的原核表达文库。提取第三轮淘选产物的噬菌体DNA,作为目的片段构建到pET14b-MCS-EGFP载体中,构建穿透肽库原核表达文库并进行后续的筛选。截止目前,已经成功构建了Hela细胞穿透肽的原核表达文库,共筛选了255条序列,得到了135条穿透肽,其中107条为不同序列的穿透肽。实验目的三是研究高丰度序列DHYHPFS的内化机制。该分子带有一个负电荷,等电点偏酸性,区别于大多数经典的穿透肽。参考以往的研究报道,我们同时选择了同样来源于文库当中的、呈碱性并带有一个正电荷的TDAKKLR作为对照进行比较研究。为了便于观察,我们将上述两个分子分别与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)相连,内化途径研究中主要考察了蛋白的时间依赖性、能量依赖性,并运用了一系列内化通路的抑制剂。考察涉及了蛋白与硫酸乙酰肝素(HS)、磷脂或受体与蛋白在细胞膜表面结合；脂筏蛋白(lipid-raft)和网格蛋白(clathrin)包裹蛋白形成囊泡；微管(microtubule)、微丝(microfilament)将包裹蛋白的囊泡转运到溶酶体(lysosome)或其他途径降解等过程。选择的内化通路相关抑制剂,包括了4℃(阻断能量供给),肝素(抑制硫酸乙酰肝素),β环糊精(抑制小窝蛋白),蔗糖(抑制网格蛋白),CytoD(降解微管),nocodazole(降解微丝)。实验结果显示两条具有不同净电荷和酸碱性的蛋白序列DHYHPFS和TDAKKLR在20μmol/L和5μmol/L浓度下,二者的内化表现形式具有不同程度的差异,暗示二者内化的途径有所区别。此外,在不同浓度下,蛋白的内化途径也发生了明显地改变。实验目的四是针对高丰度序列DHYHPFS,从携带功能分子内化活性以及细胞特异性等方面,初步探讨其生物学功能及应用价值。实验中选择了鸡贫血病毒(VP3)作为功能货物分子,该分子能诱导人转化细胞和肿瘤细胞凋亡但对正常的二倍体细胞无凋亡诱导作用。我们将凋亡素构建到穿透肽融合表达载体上,考察穿透肽辅助其内化发挥诱导肿瘤细胞凋亡的作用。另外,实验中还选择不同种类的细胞(Hela细胞,HEK293细胞,NIH3T3细胞,PC-3细胞),采用已知的不具有细胞特异性的穿透肽人免疫缺陷病毒的转录活化因子(TAT)作为对照,用以初步研究DHYHPFS分子介导内化的细胞特异性问题。实验结果显示,凋亡素与DHYHPFS的融合蛋白可以特异性内化入Hela细胞,而凋亡素与TAT的融合蛋白则未表现出细胞选择性；该融合蛋白还可以有效诱导Hela细胞的凋亡,与对照组His-DHYHPFS-EGFP比较,差异有统计学意义(t=-42.017,P=0.000)。综上所述,本论文的工作探索出了一条高效的细胞穿透肽研究途经,即应用分子生物学技术构建文库,并运用生物信息学研究方法对数据进行分析,从组学的角度对具有相似功能的一类分子的结构和性质进行分析,并挑选其中的特殊序列进行进一步的内化机制、生物学功能及应用方面的研究。本研究获得了107条具有内化活性的七肽序列,发现了区别于以往传统穿透肽分子的高丰度穿透肽序列,其内化的机制与典型正电荷穿透肽不同；并且该穿透肽可以有效携带凋亡素分子内化进入Hela细胞发挥促进凋亡的作用,并呈现一定的细胞特异性,为宫颈腺癌的靶向性治疗提供了有力可靠的分子工具,可进一步指导临床治疗方向的研究。