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绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种条件致病的革兰氏阴性杆菌,在自然界分布广泛,可导致免疫力下降及囊性纤维化(Cystic Fibrosis,CF)的患者发病率和死亡率升高,在临床中引发严重感染,是导致病人院内感染的第三大类致病菌,可同时侵染动植物。由于其内在的高抗药性及获得性抗药性,由绿脓杆菌引发的感染己越来越难以治愈。研究绿脓杆菌的致病性和耐药性调控机制,进而从新的角度防治绿脓杆菌引起的感染已变得极为重要。微生物群体感应(Quorum sensing,QS)现象的发现为研究微生物的致病调控机理提供了新的途径。群体感应是微生物中广泛保守存在的一种细胞与细胞间的通信机制,协调细菌各种群体活动,研究群体感应机制对控制和预防细菌感染至关重要。绿脓杆菌采用由las、pqs及rhl以及最新发现的IQS调控系统组成的群体感应网络协调其毒力基因表达。IQS信号系统上连中央las系统和磷酸胁迫应激反应机制,下接pqs及rhl系统。IQS的产生受las严格控制但同时也被磷酸贫乏状况激活,磷酸匮乏是细菌感染过程中的常见胁迫信号。阻断IQS合成导致pqs及rhl系统的群体感应瘫痪并显著降低菌株毒力。虽然IQS被成功分离并且其信号通路已经进行了初步的研究,但是IQS上下游调控机制并未完全清楚。因此,进一步完善IQS的调控机制对将来针对IQS调控网络寻找新的靶标来治疗绿脓杆菌造成的感染具有重要意义。本课题重点研究集成型群体感应系统的调控机制,主要工作包括以下两个部分:(1)构建Tn5转座子插入突变体库,在低磷条件下,以绿脓毒素为筛选标记筛选绿脓毒素产量降低的突变体,自37,189个突变体菌株中获得了1株绿脓毒素产量降低的PAO1插入突变体,命名为Pch996,利用hiTAIL-PCR方法获得突变基因的全序列。Pch996突变在PA5295这个基因中,该基因全长为1,677 bp,编码558个氨基酸,编码的蛋白质包含两个功能结构域,分别是GGDEF结构域和EAL结构域。与野生型PAO1相比,该突变体绿脓毒素产量降低了约35%左右。功能互补后cPch996绿脓毒素产量恢复至野生型水平,该基因与硝化还原假单胞菌Pseudomonas nitroreducens的二鸟苷酸环化酶有79%的一致性,与门多萨假单胞菌Pseudomonas mendocina的有77%的一致性。突变体Pch996不仅影响了绿脓毒素的产量,还引起其它表型的变化,如生物膜形成、群集运动能力、线虫杀死能力,但不影响游动性和弹性蛋白酶的产量。同时,通过实时荧光定量PCR检测,Pch996插入失活后,4个群体感应系统相关基因的表达量都受到了不同程度的影响。(2)通过前期研究与生物信息学的预测,对PA3192、PA3271、PA4596这3个可能的IQS调控基因进行研究。PA3192编码双组份系统的反应调节蛋白,PA3271编码双组份系统的感应蛋白,PA4596编码一个属于TetR_N家族的转录调控因子。通过基因敲除获得敲除突变体,表型测定结果表明:敲除PA3192和PA3271后,均影响了绿脓毒素产量、生物膜形成、游动性和群集性、对线虫的致死能力,不影响弹性蛋白酶产量;敲除PA4696后,绿脓毒素产量下降,运动性和群集性无明显变化,对线虫的致死能力有所减弱,不影响弹性蛋白酶产量。通过RT-qPCR检测敲除突变体4个群体感应系统相关基因的表达量,结果表明,3株敲除突变体的las、rhl、pqs和IQS群体感应系统相关基因的表达量均受到不同程度的影响。综上所述,通过转座子诱变和有针对性的基因缺失突变,本研究鉴定了4个潜在的与IQS信号通路相关的调控基因。这些发现有助于阐明绿脓杆菌QS系统的信号通路和调控机制,为进一步研究绿脓杆菌致病性和毒力的调控机理提供了有益的线索和良好的工作基础。