狂犬病是一种严重侵害大脑中枢神经的重要人兽共患传染病,是由狂犬病病毒所引起的,可感染所有的温血动物并引起致死性的脑脊髓炎,其病死率高达100%。据WHO报道全世界每年近6万人死于狂犬病,而这主要发生在发展中国家,其中亚洲和非洲占绝大多数。我国是狂犬病高发地区,近几年因狂犬病发病死亡的人数每年都高达数千人,且还有上升的趋势,我国狂犬病发病和死亡人数已居世界第二位,仅次于印度。因此,预防和治疗狂犬病的任务迫在眉睫且十分艰巨。狂犬病病毒是一个具有囊膜的不分节段的单股负链RNA病毒,是弹状病毒科狂犬病病毒属成员,主要编码核蛋白(N),磷蛋白(P),基质蛋白(M),糖蛋白(G)和聚合酶蛋白(L)等五个结构蛋白。病毒粒子呈子弹状,外部为脂质双层囊膜,其表面含G蛋白纤突,主要参与介导细胞膜融合、受体结合以及诱导宿主产生中和抗体,此外还与病毒毒力及致病性有关。M蛋白位于病毒囊膜内侧,可将核衣壳和囊膜连接起来,主要参与子代病毒的装配和出芽及病毒形态的形成。内部包裹由N蛋白、P蛋白、L蛋白及病毒基因组RNA组成的核衣壳,即核糖核蛋白复合物(RNP),作为狂犬病病毒转录与复制的模板。N蛋白主要与狂犬病病毒的转录和复制有关,在病毒的复制过程中与基因组RNA紧密结合形成N-RNA复合物,保护病毒核酸被水解且使其所在的核衣壳处于转录所需的螺旋对称结构。P蛋白与病毒在宿主细胞中成功复制具有重要作用,可作为一种干扰素的拮抗剂。L蛋白在病毒的转录与复制过程中具有十分重要的催化作用。狂犬病病毒粒子从感染的细胞中出芽释放时会携带许多可能在病毒复制过程中发挥重要作用的宿主蛋白,这些可能是由于病毒出芽时与宿主细胞膜发生融合而被携带出来并位于囊膜表面,也可能是由于与N蛋白、P蛋白和L蛋白相互作用而被携带出来并位于囊膜内部。因此鉴定与病毒蛋白相关的宿主蛋白,对于从分子水平上理解狂犬病病毒与宿主间的相互作用及病毒复制的分子机制具有重要作用,并且可为合理的研发狂犬病的靶向治疗试剂提供有力的理论依据。本研究首先在病毒培养和蔗糖密度梯度超离心纯化的基础上,采用蛋白质组学方法分析了纯化的狂犬病病毒粒子(SRV9弱毒疫苗株)上的蛋白质组成。除了检测到狂犬病病毒编码的五个结构蛋白以外,我们还检测到了50个宿主编码的蛋白。按功能可将其分成十类:胞内转运蛋白(14%),分子伴侣(12%),细胞骨架蛋白(24%),信号转导蛋白(8%),转录调节蛋白(12%),钙离子结合蛋白(6%),酶结合蛋白(6%),代谢作用蛋白(2%),泛素化蛋白(2%),其他功能的蛋白(14%)。利用免疫印迹方法对病毒粒子上的4个宿主蛋白(肌动蛋白,微管蛋白,微丝结合蛋白和热应激同源蛋白70)进行了验证。本研究首次鉴定了狂犬病病毒粒子上的宿主蛋白组成,有助于进一步研究该病毒复制与感染机制。随后从狂犬病病毒CVS-11毒株中扩增得到N和P基因全长并克隆至p Zero Back/blunt载体,再将P基因亚克隆至原核表达载体p ET-32a上,构建的原核表达重组质粒转化至原核表达菌株BL21(DE3)中,通过IPTG诱导重组P蛋白的表达,经SDS-PAGE电泳分析,可知大小约为54 k D的重组P蛋白主要以包涵体的形式表达。在变性的条件下,用Ni-NTA亲和层析纯化了重组P蛋白且纯度较高。免疫小鼠后,获得了抗P蛋白的多克隆抗体,通过间接ELISA方法检测了其抗体效价可达到1:32000,还通过IFA和Western Blot验证了制备的多克隆抗体具有良好的特异性,可识别狂犬病病毒CVS-11感染BHK细胞中表达的P蛋白。制备的多克隆抗体可用于检测筛选表达P蛋白的稳定细胞系,为进一步研究P蛋白的相关功能奠定了基础。还利用串联亲和纯化(TAP)系统将N和P基因亚克隆至真核表达载体p NTAP-B上,使表达的N和P蛋白氨基末端加上CBP-SBP串联亲和标签。将重组质粒转染至BHK-21细胞,用G418筛选稳定表达目的蛋白的细胞系。经RT-PCR、IFA及Western Blot验证了的稳定细胞系,分别扩大培养后,收获的细胞裂解液进行两步纯化,筛选与N和P蛋白相互作用的宿主蛋白,纯化得到的蛋白复合物经SDS-PAGE电泳及银染,质谱分析,去除对照组背景,分别得到与N和P蛋白相互作用宿主蛋白有41个和21个。筛选的稳定细胞系通过IFA检测其目的蛋白在细胞中的定位,可知N蛋白主要定位于细胞的细胞核内,而P蛋白主要定位于细胞的细胞质中,并且还通过提取稳定细胞系中的细胞质蛋白和细胞核蛋白进行Western Blot分析,验证了这一结果。并且通过FAT检测筛选的稳定细胞系中目的蛋白的表达对狂犬病病毒增殖的影响,发现外源的N和P蛋白的表达会抑制狂犬病病毒的增殖,并且对SRV9的抑制效果强于CVS-11。鉴于以上研究,我们通过分析狂犬病病毒粒子的蛋白质组学,检测到的50个宿主蛋白与TAP方法联合质谱分析分别筛选得到41个和21个与N和P蛋白相互作用的宿主蛋白相比,分别有9个和6个宿主蛋白存在于狂犬病病毒粒子上。还发现N蛋白主要定位于其稳定细胞系的细胞核内,而P蛋白主要定位于其稳定细胞系的细胞质中,同时稳定细胞系中N和P蛋白的表达对狂犬病病毒的增殖有抑制作用,并且抑制SRV9增殖强度大于CVS-11。本研究鉴定了狂犬病病毒粒子的蛋白质组成及与N和P蛋白相互作用的宿主蛋白,为进一步研究该病毒的复制和感染机制奠定了基础。