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肝豆状核变性又称Wilson病(Wilson’s disease,WD),是一种常染色体隐性遗传铜代谢障碍性疾病。WD患者因位于13q14.3的ATP7b基因发生突变,出现铜蓝蛋白(ceruloplasmin,CP)合成障碍及铜在胆汁中的排泄障碍,并导致过量的铜在肝脏、脑、肾脏、角膜等组织脏器中沉积,患者可出现肝硬化、神经/精神症状、角膜K-F环等临床表现,严重者可危及生命。WD是少数可以治疗的神经遗传病之一,但以金属络合剂为主的治疗方法因毒副反应使许多患者不能耐受,严重影响本病患者的病情和预后。上世纪70年代以来,本课题单位以中药肝豆汤治疗WD患者获得良好疗效。虽然我们发现肝豆汤有显著的细胞内排铜作用,但其产生疗效的确切机制尚不明确。本课题在前期研究基础上进一步探讨肝豆汤对WD模型-TX小鼠肝细胞内铜转运通路相关蛋白的调控作用,在分子水平初步阐明肝豆汤改善WD患者临床症状的疗效机理。目的:研究肝豆汤调控TX小鼠肝细胞内铜转运通路的分子靶点并观察其相应的调控机制。方法:采用原子吸收法检测含肝豆汤兔血清作用不同浓度、不同时间点,对TX小鼠肝细胞内铜含量的影响;原子吸收法检测不同浓度含肝豆汤兔血清作用24h后,对TX小鼠肝细胞内微量元素的影响;FITC染色经流式细胞仪检测经含肝豆汤兔血清孵育后TX小鼠肝细胞内ATP7b,CTR1,ATOX1,CCS,MT,COX17相关蛋白的表达;Western blotting法检测经含肝豆汤兔血清作用后ATP7b,CTR1,ATOX1,CCS,MT,COX17相关蛋白的表达;免疫荧光双标记经激光共聚焦显微镜观察由含肝豆汤兔血清孵育后TX小鼠肝细胞内ATP7b蛋白的亚细胞定位变化。结果:1.含肝豆汤兔血清对TX小鼠肝细胞内铜代谢的调控(1)原子吸收法实验结果表明含肝豆汤兔血清在一定时间和浓度范围内可显著降低TX小鼠肝细胞内铜含量,且呈一定的时效和量效关系。(2)与DL组相比,含肝豆汤兔血清作用24 h后可显著降低TX小鼠肝细胞内铜含量,增加锌含量,降低铁含量(P<0.01)。(3)Western blot法和FITC染色流式细胞仪检测结果显示,经含肝豆汤兔血清作用后可显著(P<0.01)增加ATP7b蛋白表达。(4)Western blot法和FITC染色流式细胞仪检测结果显示,含肝豆汤兔血清剂量依赖性激活铜代谢相关蛋白ATOX1、CCS、COX17的表达(P<0.01)。(5)Western blot法和FITC染色流式细胞仪检测显示含肝豆汤兔血清显著降低CTR1、MT蛋白表达(P<0.01)。2.含肝豆汤兔血清对TX小鼠肝细胞内ATP7b蛋白亚细胞定位和功能表达的影响(1)免疫荧光结果显示,ATP7b蛋白在DL小鼠肝细胞内定位于TGN,位于高铜环境中则转运至顶端膜区,去除高铜环境则重新定位于TGN。(2)ATP7b蛋白在TX小鼠肝细胞内不能定位于TGN及顶端膜区域,去除高铜环境也不能促使ATP7b蛋白重新定位于TGN。中药肝豆汤可促使ATP7b蛋白逐步重新定位于TGN。结论:肝豆汤可能是通过调控细胞内铜代谢相关蛋白,上调ATP7b、ATOX1、CCS、COX17蛋白表达,抑制CTR1、MT表达,从而发挥细胞内排铜作用。肝豆汤可以通过诱导ATP7b蛋白重新定位于TGN,进而发挥细胞内排铜作用,改善WD的临床症状。肝豆汤可通过多靶点、多途径调控铜代谢通路达到降低肝细胞内铜含量的治疗效果。