【摘 要】
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目的:1、检测微小RNA-21（miR-21）和Wnt/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）通路在牙周膜干细胞（Periodontal ligament stem cells）成骨分化过程中的表达差异;2、探索miR-21对PDLSCs成骨分化的调控作用及其潜在通路机制。方法:1、采用组织块培养法获取原代细胞,并通过有限稀释法纯化,进而行细胞克隆、细胞生长周期检测、细胞表型鉴定、免疫荧光化学
【基金项目】
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项目名称:Th17/IL-17骨免疫通路在正畸相关炎性牙根吸收中的作用机制研究,项目合同编号:81360170,项目来源:地区科学基金项目,项目起止时间:2014-01至2017-12
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目的:1、检测微小RNA-21（miR-21）和Wnt/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）通路在牙周膜干细胞（Periodontal ligament stem cells）成骨分化过程中的表达差异;2、探索miR-21对PDLSCs成骨分化的调控作用及其潜在通路机制。方法:1、采用组织块培养法获取原代细胞,并通过有限稀释法纯化,进而行细胞克隆、细胞生长周期检测、细胞表型鉴定、免疫荧光化学染色以及成骨成脂分化实验。2、采用间充质干细胞成骨诱导液诱导PDLSCs骨向分化,建立牙周膜干细胞的骨向分化模型。采用WB及RT-PCR方法检测牙周膜干细胞诱导后的0、3、5、7、14及21d时ALP及RUNX-2的表达,同时,检测miR-21及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达差异。另外,免疫荧光化学染色法观察该过程中β-catenin的核移位情况。3、采用慢病毒转染牙周膜干细胞,分别过表达及沉默miR-21,并继续诱导其骨向分化至7d,采用WB及RT-PCR检测miR-21、ALP及RUNX-2、以及Wnt/β-catenin通路相关因子的表达变化。结果:1、体外培养法成功获得原代细胞,进行稀释并纯化后,得到牙周膜干细胞;细胞克隆实验证明所获得牙周膜干细胞具有较高的细胞克隆率（15%）;细胞周期检测显示处于G0/G1期的占比为77.69%,符合干细胞慢性增值的生长特点;流式细胞表型鉴定STRO-1（81.5%）,CD146（99%）,CD45（0.15%）,表明所获得的牙周膜干细胞为间充质来源;免疫荧光结果显示波形蛋白（Vimentin）呈强阳性表达,而角蛋白（Cytokeratin）呈阴性,表明本实验使用的牙周膜干细胞为中胚层来源,而非外胚层;成骨及成脂分化实验显示,有较明显的成骨结节及脂滴形成,证明牙周膜干细胞可以多向分化,具有干细胞的多向分化特性。2、WB及RT-PCR结果显示,与对照组相比,在牙周膜干细胞成骨分化过程中,ALP及RUNX-2的表达升高,并在7d时达到峰值,差异与对照组相比具有统计学意义（P<0.05）;miR-21在这一过程中,亦呈升高的趋势,在14d时达到峰值,差异具有统计学意义（P<0.05）;同时,Wnt/β-catenin信号通路上下游标志物亦呈差异性表达,其中,与对照组相比,细胞周期蛋白D1（Cyclin D-1）的表达呈逐渐升高趋势,总β-catenin、磷酸化-糖原合成酶激酶3（p-GSK3β）的表达均呈先升高后下降趋势;差异具有统计学意义（P<0.05）;胞浆β-catenin（Cy-β-catenin）的表达在7d时表达稍有下降,其他时间点的表达随时间逐渐升高（P<0.05）;β-catenin免疫荧光结果显示,其随诱导时间增加而逐渐由胞浆向核内移位。3、牙周膜干细胞转染病毒并诱导至7d时,与对照组及抑制组相比,在过表达组（miR-21+）中,miR-21的表达明显升高（P<0.01）;与此同时,ALP及RUNX-2、Cyclin D-1、β-catenin及p-GSK3β的表达均显著升高（P<0.05）;而与过表达组及对照组相比,在抑制组（miR-21-）中,miR-21的表达显著下调（P<0.01）,ALP及RUNX-2、β-catenin、Cyclin D-1及p-GSK3β的表达均明显下调（P<0.05）。结论:1.本实验成功分离培养牙周膜原代细胞,并经过细胞来源及干细胞特性鉴定,证实纯化后所获得的细胞为间充质来源的牙周膜干细胞,具有干细胞特性。2.miR-21可通过Wnt/β-catenin信号通路促进牙周膜干细胞的成骨分化。
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