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本研究以家蚕(大造)为研究材料,首先采用半定量RT-PCR方法研究了家蚕在不同发育时期经LPS(脂多糖)和Bt(苏云金杆菌,Bacillus thuringiensis)刺激后Bm Serpin-6基因的转录水平变化,然后研究了家蚕从幼虫到成虫整个发育过程中不同阶段BmSerpin-6基因的转录水平变化,最后采用Bac-to-Bac系统表达了BmSerpin-6蛋白,主要研究结果如下:
(一)不同龄期的BmSerpin-6在经过两种刺激物免疫刺激后转录水平都呈先上升后下降的趋势,但转录水平上升至最高点的时间不一样:其中LPS刺激四龄眠蚕6h BmSerpin-6转录水平最高,LPS刺激五龄起蚕9h BmSerpin-6转录水平最高;Bt刺激四龄眠蚕3h BmSerpin-6转录水平最高,Bt刺激五龄起蚕6h BmSerpin-6转录水平最高,Bt刺激五龄三天蚕9h BmSerpin-6转录水平最高。实验结果进一步说明了Bm Serpin-6基因与家蚕免疫相关。4龄眠蚕、5龄起蚕和5龄3天蚕受刺激后Bm Serpin-6基因转录水平在前期都显著上调;同一种刺激物刺激不同发育时期的家蚕,转录水平上升至最高点的时间不一样,我们推测可能是由于不同发育时期的家蚕抗性水平不一致,受不同刺激物诱导家蚕生理代谢受影响的程度不一致。
(二)BmSerpin-6基因在家蚕不同发育时期的转录水平具有明显的时空特异性:
(1)在各个起蚕期BmSerpin-6转录水平无明显变化,但在眠起过程中变化显著,4龄眠蚕转录水平明显高于五龄起蚕。
(2)在家蚕五龄期不同发育时间转录水平有很大差异,BmSerpin-6在5龄1-3d的转录水平很低,5龄4d转录水最低,后逐渐升高,在5龄6d达到最高。
(3)在熟蚕未吐丝前BmSerpin-6转录水平很高,在吐丝开始后降到最低,随着吐丝时间的延长转录水平逐渐上升。
(4)在蛹期BmSerpin-6转录水平随着化蛹时间的延长呈先上升后下降的趋势,在化蛹6d最高,化蛹13d最低。成虫期BmSerpin-6转录水平与刚化蛹时接近。
(5)BmSerpin-6基因在5龄期家蚕精巢和卵巢中的转录水平均呈先下降后上升的趋势。
由此看来,BmSerpin-6除了参与免疫反应,可能还具有其它生理功能。
(三)采用苜蓿银蚊夜蛾Bac-to-Bac系统表达了BmSerpin-6蛋白。收集细胞进行SDS-PAGE和Western Blot分析,结果在46kD左右出现一条特异性条带,与预计融合蛋白大小相符,说明目的蛋的得到了表达。为进一步研究BmSerpin-6的功能打下了物质基础。
本文通过两种诱导物刺激4龄眠蚕、5龄起蚕和五龄3d蚕,系统地研究了家蚕动态发育过程中BmSerpin-6基因的转录水平与免疫刺激的关系,实验结果说明BmSerpin-6基因转录水平受免疫刺激影响变化显著,推测BmSerpin-6参与家蚕先天性免疫;通过对家蚕整个发育过程中不同阶段BmSerpin-6基因转录水平进行研究,结果表明,BmSerpin-6除了参与调节免疫作用以外,可能还具有其它生理功能;最后通过真核表达接近天然蛋白活性的BmSerpin-6,为其功能研究提供了物质基础。