第一部分垂体瘤卒中分子机制的免疫组化研究研究背景与目的：垂体瘤卒中是垂体瘤发生出血、梗塞或梗死后出血所导致的临床综合症。目前关于垂体瘤卒中发生机制还不清楚。近年来,很多学者对多种出血性疾病的发生机制进行相关研究后发现VEGF、MMP酶、细胞因子、细胞凋亡、血栓、血管痉挛等可能在出血卒中的发生中起到一定作用。上述因素是否也参与垂体瘤卒中发生发展过程尚未见相关报道。本研究通过对卒中和非卒中垂体瘤组织进行研究,探讨上述因素在垂体瘤卒中发生中的可能作用。鉴于有研究报道出血本身可能导致个别上述责任蛋白在局部出血组织中表达水平升高,为了排除这种潜在的假阳性,我们采用对裸鼠皮下垂体瘤模型进行瘤内血液注射的方法来确认出血是否对垂体瘤组织中上述蛋白表达产生影响。方法：收集卒中和非卒中垂体瘤组织各30例,应用免疫组化、Western blot和Tunel染色的方法检测先前文献报道的出血直接责任因素水平：VEGF、MMP9蛋白、凋亡和间接责任因素水平：瘤内缺氧(HIF-1α、PCNA)、细胞因子(TNFα、IL-6、IL-10)、血栓(TF)。对成瘤3周的裸鼠皮下移植瘤注射裸鼠血液500μl,48小时后收取肿瘤行蛋白提取。通过Western blot分析血液注射对垂体瘤组织VEGF、MMP9、TNFα、PCNA、TF和HIF-1α蛋白表达的影响。结果：免疫组化和Western blot结果显示卒中组中VEGF、MMP9、HIF-1α、TF、PCNA、TNFα和BNIP3蛋白水平显著高于非卒中组。IL-6,IL-10蛋白水平在卒中组和非卒中组没有明显差别。Tunel染色显示卒中组比非卒中组的细胞凋亡率更高。此外,血液注射组皮下移植瘤的MMP9和TF蛋白水平较对照组高。对比人垂体瘤卒中组较非卒中组中MMP9和TF蛋白的增高程度,移植瘤血液注射组的MMP9升高程度远低于人垂体瘤卒中组MMP9升高程度,而两组组织中TF的升高程度却基本形同。结论：卒中垂体瘤组织中VEGF、MMP9、TNFα、PCNA、HIF-1α蛋白水平和凋亡率显著高于非卒中组。上述责任因素可能在垂体瘤卒中发生过程中起到一定作用。卒中垂体瘤组织中TF升高可能是由于出血本身造成的,人卒中垂体瘤组织中TF水平升高不能提示TF在出血过程中发挥促进作用。第二部分肿瘤坏死因子在垂体瘤出血发生过程中的作用研究背景与目的：第一部分研究结果提示TNFα、VEGF、MMP9蛋白可能在垂体瘤卒中发生过程中起到一定作用。由于TNFα能够上调VEGF、MMP9蛋白表达,近来研究报道TNFα通过诱导的VEGF和MMP9蛋白表达上调参与多种类型出血的发生过程。目前尚不清楚TNFα是否也参与垂体瘤出血性转化的发生过程。本研究中我们应用垂体瘤MMQ细胞裸鼠皮下移植瘤模型来探讨TNF-α在垂体瘤卒中发生过程中的作用,我们还通过TNF-α刺激MMQ细胞的体外细胞学实验进行相关的机制研究。方法：通过皮下注射MMQ细胞建立垂体瘤MMQ细胞裸鼠皮下移植瘤模型。载瘤鼠分5组,每组5只。分别行生理盐水、rhTNF-α(10,000 U/kg i.m.)、rhTNF-α+VEGF抑制剂贝伐单抗Bevacizumab (10 mg/kg i.p.)、rhTNF-α+MMP9抑制剂GM6001(10 mg/kg i.p.)和rhTNF-α+贝伐单抗+GM6001注射,VEGF和MMP9抑制剂在rhTNF-α注射前一周开始应用并持续rhTNF-α注射整个过程。rhTNF-α每周两次共两周,VEGF和MMP9抑制剂每周两次共3周。HE染色和Western blot检查各组裸鼠移植瘤中血管出血性转化数量和VEGF、MMP9蛋白的表达情况。体外用TNF-α(20 ng/mL)和/或Bevacizumab (5 mg/mL)刺激MMQ细胞并行Realtime PCR、Western blot和明胶酶谱检查VEGF和MMP9的表达。结果：rhTNF-α(5/5)注射能够促使MMQ细胞裸鼠皮下移植瘤发生出血性转化,而Bevacizumab (2/5)、GM6001 (3/5)和Bevacizumab+GM6001 (1/5)能够削弱但不能消除rhTNF-α的出血性转化促进作用。Western blot提示rhTNF-α能够上调移植瘤瘤组织的VEGF和MMP9蛋白的表达,Bevacizumab和GM6001分别抑制rhTNF-α诱导的VEGF和MMP9蛋白表达上调。体外实验提示rhTNF-α(20 ng/mL)能够上调MMQ细胞中VEGF和MMP9的表达。Bevacizumab (5 mg/mL)只能抑制rhTNF-α诱导的VEGF上调作用,而对rhTNF-α诱导的MMP9上调作用没有影响。结论：TNF-α可能参与垂体瘤发生出血性转化的发生。TNF-α-VEGF和TNF-α-MMP9信号通路可能是TNF-α促使垂体瘤发生出血性转化的分子机制。第三部分组织缺氧在垂体瘤卒中发生过程中的作用研究背景与目的：第一部分结果提示卒中垂体瘤组织中细胞凋亡率、HIF-1α、VEGF、PCNA和BNIP3蛋白表达水平较非卒中组织明显升高,提示上述因素可能在垂体瘤卒中发生过程中起到一定作用。近来研究报道在组织缺氧条件下,HIF-1α能够通过诱导VEGF和BNIP3凋亡蛋白表达上调而参与多种出血过程的发生。目前尚不清楚HIF-1α是否也参与垂体瘤出血性转化的发生过程。本研究中我们通过慢病毒介导HIF-1α基因转染MMQ细胞建立过表达HIF-1α的MMQ细胞系(MMQ/HIF-1α),并将MMQ/HIF-1α细胞皮下注射于裸鼠皮下制成垂体瘤细胞皮下移植瘤模型,以研究HIF-1α在垂体瘤出血性转化发生过程中的作用。方法：HIF-1α过表达病毒液转染MMQ细胞,48小时后荧光显微镜下挑取转染成功的显现荧光的MMQ/HIF-1α细胞并扩增传代。siRNA HIF-1α瞬转MMQ细胞,分别用Realtime PCR、Western blot和流式凋亡检测MMQ/HIF-1α、空载体MMQ细胞、si HIF-1αMMQ细胞和对照MMQ细胞的VEGF、BNIP3和凋亡率的变化。分别将MMQ/HIF-1α细胞,空载体MMQ细胞和对照MMQ细胞(1xl06)皮下注射裸鼠建立垂体瘤MMQ细胞裸鼠皮下移植瘤模型。载瘤鼠分3组,每组5只。种植4周后,收集移植瘤行HE、Realtime PCR、Western blot和Tunel检测血管出血性转化、VEGF、BNIP3和组织细胞凋亡率的变化。结果：与对照组MMQ细胞相比,HIF-1α过表达能够上调MMQ细胞VEGF和BNIP3的表达,并促使细胞凋亡的发生。siHIF-1α能够下调MMQ细胞VEGF和BNIP3表达,并抑制凋亡的发生。体内试验显示HIF-1α过表达促使MMQ细胞裸鼠皮下移植瘤瘤内血管发生出血性转化,此外HIF-1α过表达还能够上调VEGF和BNIP3蛋白的表达,并促使移植瘤瘤组织凋亡的发生。结论：在局部组织缺氧条件下HIF-1α可能参与了垂体瘤出血性转化的发生发展过程。HIF-1α-VEGF和HIF-1α-BNIP3-凋亡信号通路可能是HIF-1α促使垂体瘤发生出血性转化的分子机制。