论文部分内容阅读
背景:刚地弓形虫简称弓形虫（Toxoplasma gondii,T.gondii）,是一种只寄生在有细胞核的细胞内,在世界各地均有发现的人兽共患寄生原虫。弓形虫能够感染几乎所有的恒温脊椎动物,包括人在内,人和动物被感染后可引起弓形虫病。该病不仅给畜牧业造成严重的经济损失,也给人类健康带来潜在的威胁。目前尚无特效疫苗和药物来预防或治疗该病。目的:本课题通过对弓形虫与唾液酸受体结合的全蛋白质组的初步分析,选取唾液酸结合蛋白质假定TCP-1进行后续研究。关于弓形虫假定TCP-1蛋白质的研究目前尚未见有任何报道。本研究对其是否与唾液酸结合进行了体外验证,从而探究弓形虫依赖唾液酸途径侵入宿主细胞的机理,为研制新的抗弓形虫药物提供新的方向。方法:纯化弓形虫RH株速殖子,Biozol法提取总RNA,反转录成cDNA后进行PCR扩增。回收目的片段,回收产物克隆至T载体中,转化至大肠杆菌感受态,提取质粒测序,测得的序列进行生物信息学分析。构建原核表达载体表达蛋白质,利用亲和层析法纯化重组蛋白质,SDS-PAGE和Western-blot验证纯化的重组蛋白质。HIS-TCP-1蛋白质与弗氏佐剂乳化,免疫SD大鼠和家兔制备多抗。利用多抗进行亚细胞定位及体外抑虫实验,并运用纯化的GST-TCP-1蛋白质进行功能分析。结果:RNA提取结果良好,成功扩增出TGME49318410基因全长序列,生物信息学分析该蛋白质无信号肽和跨膜区,比较保守,抗原性较强。成功构建出原核表达载体（pGEX-4T-1-TCP-1和pET28a-TCP-1）,小量诱导表达后经过SDS-PAGE发现蛋白质在上清中表达。成功纯化出两种不同标签重组蛋白质（HIS-TCP-1和GST-TCP-1）,经SDS-PAGE和Western-lot验证蛋白质大小与预测大小一致,且比较纯净基本无其它杂蛋白。四次免疫实验动物后,ELISA方法检测抗体效价滴度达1:16,000。间接免疫荧光实验发现蛋白质主要分布在虫体胞浆内。该蛋白质与唾液酸结合,并且能够黏附到小鼠树突状细胞表面。不同浓度的抗体IgG均能够抑制虫体入侵宿主细胞。结论:假定TCP-1蛋白质抗原性强,主要定位虫体的胞浆内,能够与唾液酸结合,与小鼠DC细胞黏附,体外抑虫实验表明抗体能够阻断虫体入侵宿主细胞。