论文部分内容阅读
流感病毒属于正黏病毒科,流感病毒属。流感病毒是重要的人兽共患性病原,可引起人和多种动物感染和发病。流感病毒的高变异性极易引起流感大流行和跨种间传播,对人类的生命安全构成重大的威胁。因此,抗流感病毒药物研发具有重要的意义。通过全基因组siRNA文库以及报告性流感病毒可以实现对参与流感病毒复制调控的宿主因子的高通量筛选,为抗流感病毒药物研发提供潜在的靶点。本实验室前期通过全基因组siRNA文库以及H5N1 NA-Venus报告病毒筛选出参与流感病毒复制调控的宿主因子。结合siRNA文库筛选标准,确定了宿主因子跨膜和泛素样结构域蛋白1(Transmembrane and ubiquitin-like domain-containing 1,TMUB1)。在本研究中,通过蚀斑实验证实利用siRNA干扰下调TMUB1表达以及利用CRISPR/Cas9技术敲除TMUB1均可显著抑制流感病毒复制。为了探究TMUB1影响流感病毒生活周期的具体阶段,本研究通过Western杂交检测TMUB1对流感病毒感染后不同时间点病毒蛋白表达的影响,发现TMUB1敲除后在病毒感染4 h时可显著抑制各个病毒蛋白的表达,证实TMUB1影响病毒感染的早期阶段。于是本研究利用多种方法探究TMUB1对流感病毒侵入阶段的影响,通过流式细胞仪检测证实TMUB1对流感病毒的吸附阶段无影响;通过酸洗实验证实TMUB1对流感病毒的内吞阶段无影响;通过Lysotracker red DND-99染料和流感病毒M1蛋白免疫荧光染色观察,发现TMUB1对细胞的酸性细胞器pH值以及流感病毒的膜融合阶段无影响;通过对流感病毒NP蛋白免疫荧光染色观察发现,TMUB1敲除后可显著抑制流感病毒vRNP的入核阶段。进一步通过双荧光素酶实验以及免疫共沉淀实验证实TMUB1对流感病毒的聚合酶活性无影响。TMUB1为细胞周期负调控蛋白,为了探究TMUB1是否通过对细胞周期的调控促进流感病毒复制,本研究利用流式细胞仪检测发现TMUB1敲除后有利于细胞周期的向下进行,且TMUB1敲除后导致流感病毒失去对细胞周期G0/G1期的阻滞作用。为了进一步探究TMUB1通过调控细胞周期影响流感病毒复制的分子机制,本研究通过q RT-PCR检测TMUB1敲除后对细胞周期G1/S期相关蛋白mRNA转录水平的影响,发现TMUB1敲除后,cylinE mRNA转录水平明显增加;通过qRT-PCR以及Western杂交检测发现,TMUB1敲除后导致流感病毒失去对cylinE m RNA转录以及蛋白表达的抑制作用。本研究证实TMUB1为促进流感病毒复制的宿主因子,并且主要影响流感病毒复制周期的病毒vRNP入核阶段;流感病毒可能通过与TMUB1相互作用抑制cylin E表达,将细胞周期阻滞于G0/G1期,从而促进流感病毒自身的复制。本研究阐明了宿主因子TMUB1通过调控细胞周期促进流感病毒复制的分子机制,为抗流感病毒药物的开发提供潜在的靶点。