研究背景骨肉瘤是一种儿童及青少年最常见的恶性骨肿瘤，高发于四肢长骨的干骺端。目前常规的化疗药物均为细胞毒性药物，副作用大。几乎一半的儿童期肿瘤幸存者因为抗肿瘤治疗至少承受一个不良后果。化疗药物早期毒性包括血液系统毒性，急性肝脏毒性和肾毒性。生存期的延长导致了晚期化疗毒性的增加。主要的晚期毒性有：心脏毒性、继发肿瘤、不育、慢性肾衰竭和神经系统毒性。因此寻找低毒的抗骨肉瘤药物具有重要的临床意义。紫檀芪（PTE）是一种来源于我们食物的天然化合物，毒性极低，对人体是安全的。PTE是白藜芦醇的二甲基化类似物，具有多种生物学活性，可以抗炎、抗氧化、抗增殖、抗肿瘤及止痛。因甲氧基团替代了羟基增加了亲脂性，增加了生物利用度，从而增加了活性。研究表明PTE可以抑制多种肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡，包括肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌及白血病等。PTE是否具有抗骨肉瘤作用目前尚无人研究。PTE抗肿瘤作用涉及多种细胞分子和信号通路，如单磷酸腺苷活化激酶(AMPK)、细胞基质钙超载、活性氧（ROS）、自噬、Wnt信号通路及溶酶体膜通透作用增强等，但具体的抗肿瘤机制目前尚不清楚。JAK/STAT通路对体内多种信号的转导都非常的关键，对多种哺乳动物发育及内环境的稳定都异常的重要。JAK家族包括JAK1、JAK2、JAK3及酪氨酸激酶2，这4个蛋白结构及功能相似。JAK的活化在细胞增殖、分化、迁移及凋亡中均有重要的作用。结构活化的JAKs会使细胞内许多重要的物质磷酸化，其中包括STAT家族，STAT家族中的STAT3与许多肿瘤的信号通路相关。结构活化后的STAT3和人实体肿瘤细胞的存活与生长关系密切。STAT3还可上调人肿瘤细胞抗凋亡基因编码的Mcl-1、Bcl-xL蛋白。PTE可以抑制STST3的磷酸化，磷酸化的STST3是一种肿瘤快速生长的标志。更为重要的是活化的JAK2/STAT3信号作为治疗实体肿瘤一个重要的目标分子已经被广泛的确认其有效性。PTE抗骨肉瘤的作用是否与抑制JAK2/STAT3通路的磷酸化程度有关目前尚不清楚。第一部分PTE抗人骨肉瘤细胞活性研究研究目的研究PTE对人骨肉瘤细胞生长及凋亡的影响；研究PTE对人骨肉瘤细胞迁移及粘附能力的影响。研究方法1.细胞培养及处理人骨肉瘤细胞系SOSP-9607(9607)，复苏后在10%的胎牛血清DMEM液中培养，加入L-谷酰胺、青霉素、链霉素及HEPES液。孵箱内温度维持在37°C，CO2浓度为5%。收集细胞备用。PTE原液中加入二甲基亚砜，以培养液稀释，即配即用。对照组中加入0.01%的二甲基亚砜。实验组加入PTE，浓度梯度为1、2及4μM。2.细胞活力检测细胞预处理后以PBS液洗涤三次，加入MTT液，37°C的孵箱中孵育4h，加入二甲基甲酰胺，震荡，在酶联免疫监测仪上检测细胞活力。细胞活力以各孔吸光值（OD）的形式记录，测定各孔光吸收值，记录结果，绘制细胞生长曲线。并在倒置相差显微镜下观察细胞形态、照相。3.细胞周期分析细胞预处理后胰酶消化，70%的乙醇固定后PBS液洗涤，加入核糖核苷酸及碘化丙啶，避光室温下孵育30min。以配备数据采集及分析系统的流式细胞仪分析并记录数据。结果以荧光密度分布图的形式表示，荧光密度代表细胞数目。4.线粒体跨膜电位（MMP）分析将细胞放入六孔板中加入不同浓度的PTE，孵育24h。以PBS液洗涤，加入JC-1工作液，避光37°C孵育。细胞洗涤后悬浮于PBS液中，将染色的细胞用上述流式细胞仪分析，结果以较低MMP的细胞比例表示。5.细胞凋亡分析将细胞预处理后，冰PBS液冲洗，加入荧光标记的共轭膜联蛋白及碘化丙啶，使用上述流式细胞仪检测细胞凋亡情况并用相关软件进行分析。碘化丙啶阴性且共轭膜联蛋白阳性的细胞被认为是早期凋亡细胞，双阴性细胞被认为是正常细胞。6.划痕试验培养细胞至铺满瓶底后，微量管尖端在单层细胞处制造划痕。将分离的细胞以PBS洗涤干净，加入PTE24h后，使用显微镜观察并记录划痕边缘距离变化情况。结果以每组划痕之间的距离数值表示。7.细胞粘附实验PTE处理骨肉瘤细胞24h后消化、离心，悬浮在加入10%胎牛血清的DMEM液中。37°C下孵育30min，PBS液洗涤。将贴壁细胞用法MTT染色，在倒置相差显微镜下观察细胞粘附情况并照相。加入二甲基甲酰胺，37°C下震荡孵育15min，在490nm条件下使用分光光度计测量，结果以OD值表示，将对照组OD值设为100%。8.统计学分析所有的样本一式两份，重复至少3次，数据已平均值±标注差的形式表示。实验组间比较使用SPSS12.0，采用方差分析的方法(ANOVA)。差异P<0.05被认为统计学上有意义。研究结果1. PTE对骨肉瘤细胞生长及凋亡的影响骨肉瘤细胞培养液中加入1,2及4μM浓度梯度的PTE后，分别培养12、24及36h，细胞生长均出现抑制。PTE对骨肉瘤细胞的生长抑制作用呈剂量和时间依赖。培养至24h时PTE的IC50(50%抑制浓度)约为1.81μM。与对照组比较，PTE导致细胞粘附率下降。加入1、2及4μM PTE后，与对照组相比较，凋亡指数分别增加16.75±3.91%、21.55±3.26%及35.87±4.23%(P<0.01)。我们发现凋亡指数呈剂量依赖性。这个结果说明PTE对人骨肉瘤细胞有生长抑制及诱导凋亡的作用。2. PTE对骨肉瘤细胞迁移及粘附能力的影响加入1、2及4μM的PTE，孵育24h后，随着浓度的增加，划痕边缘的距离显著增加，分别增加至对照组的123.07±9.05%、161.53±8.28%及223.08±11.30%(P<0.01)。粘附细胞显著减少，粘附率分别为对照组的62.29±9.43%、34.38±6.70%及13.64±3.35%(P<0.01)。这些结果表明PTE可以降低骨肉瘤细胞的迁移能力及粘附能力。3. PTE对骨肉瘤细胞MMP的影响加入1、2及4μM的PTE，孵育24h后，低MMP细胞的比例显著增加。各组低MMP的细胞比例分别增加至8.19±2.36%、16.17±2.68%及29.45±3.10%(与对照组比较，P<0.01)。结果表明PTE可以增加骨肉瘤细胞的MMP。4. PTE对骨肉瘤细胞周期的影响与对照组相比较，加入不同浓度的PTE后均会导致细胞G0-G1阶段的聚积。G0-G1阶段的细胞由对照组的33.27%增加至4μM PTE组的55.22%，可见PTE会导致细胞周期G0-G1期的阻滞。结论PTE具有很强的抗人骨肉瘤细胞活性的作用。PTE导致人骨肉瘤细胞G0-G1期阻滞，使细胞生长出现抑制；同时PTE降低了MMP，诱导了细胞的凋亡。PTE还可以减少骨肉瘤细胞的粘附能力及迁移能力。第二部分PTE抗人骨肉瘤细胞活性的机制研究研究目的：研究PTE抗人骨肉瘤细胞活性的相关机制。研究方法1.细胞培养及处理同第一部分最后一步实验中加入AG490，PTE的浓度为4μM2.细胞内活性氧（ROS）及谷胱甘肽水平（GSH）检测细胞预处理后胰酶裂解，加入DCFH-DA液，37oC下孵育2h。FLX800微量盘荧光光谱仪测量每孔二氯荧光素的强度。无细胞孔作为背景，将对照组荧光强度定为100%。细胞加入培养皿中过夜后加入PTE24h后。PBS洗涤细胞。根据探针的操作指南，将细胞裂解后测量GSH的水平。在测量前1h用2-乙烯基吡啶遮蔽GSH。GSH和GSSG的含量与正常标准的蛋白含量比较。结果以GSH的表达（%对照含量）或GSH/GSSG比例的形式表达，使用还原形式的GSH或氧化形式的GSH（GSSG）作为标准。3. Westen Blotting将细胞样本在样本缓冲液中裂解，降噪处理，煮沸，跑凝胶，转膜，封闭。加入p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、Mcl-1、Cyclin D1、p21、p27、Bcl-xL、Bax、Bak及GAPDH的抗体4oC过夜。洗膜，加入对应的二抗，室温下放置90min，洗涤。使用BioRad成像系统观察记录荧光强度，并以Image Lab软件定量分析。4.细胞质中细胞色素C的萃取处理离心细胞，PBS液洗涤2次后悬浮于冰的细胞萃取缓冲液中，4oC下孵育40min，离心，上清液用来提取细胞色素C，加入5倍上清的缓冲液，100oC下煮沸7min，将蛋白溶液用Western blotting的方法测定细胞色素C的含量。5.统计学分析同第一部分研究结果1. PTE对细胞周期相关蛋白的影响为了进一步验证细胞G0–G1阻滞，我们利用Westernblotting的方法检测周期蛋白D1、p21及p27的表达。与细胞周期阻滞一致，Cyclin D1的表达水平降低，而p21和p27的表达水平升高。这个发现表明PTE可以导致细胞周期相关蛋白表达的变化。2. PTE对骨肉瘤细胞活性氧生成及谷胱甘肽水平的影响加入1、2及4μM的PTE，孵育24h后骨肉瘤细胞内产生的活性氧呈剂量依赖关系，分别增加至对照组的255.32±12.97%、411.59±16.24%及503.61±17.05%(与对照组比较，P<0.01)。加入1、2及4μM的PTE，孵育24h后骨肉瘤细胞谷胱甘肽水平呈剂量依赖性降低，分别降低了80.51±3.06%、66.43±3.82%及52.30±3.49%。(与对照组比较，P<0.01)。PTE会导致骨肉瘤细胞内GSH/GSSG的比例呈剂量依赖性降低。3.对人骨肉瘤细胞JAK2/STAT3信号通路及线粒体凋亡通路相关蛋白的影响加入PTE后磷酸化的JAK2及STAT3的表达水平降低。与磷酸化的JAK2及STAT3的表达下调相一致的是PTE使Mcl-1和Bcl-xL的表达水平也降低，且呈剂量依赖关系。除此之外PTE使线粒体凋亡通路相关蛋白(Bax、Bak、细胞色素C)的表达上调。4. PTE联合AG490对人骨肉瘤细胞活力及JAK2/STAT3信号的影响联合应用PTE（4μM）和AG490(一种已知的JAK2/STAT3抑制剂，20μM)进一步抑制了骨肉瘤细胞的活力(与单独的PTE组或AG490组比较，P<0.01)。并且联合应用PTE和AG490也进一步抑制了JAK2及STAT3的磷酸化程度。结论PTE通过抑制JAK2/STAT3信号通路影响CDK/Cyclin复合物和CKIs的平衡，导致了细胞G0-G1期阻滞，使人骨肉瘤细胞出现了生长抑制；同时活化内源性线粒体凋亡途径，诱导了人骨肉瘤细胞的凋亡。