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研究背景研究表明,自噬在神经元中受到严格的调控,自噬功能的失调和神经元的退行有重要的联系,自噬在清除与神经变性疾病相关的错误折叠蛋白和易聚集蛋白方面起关键作用,尤其在帕金森病(PD)的发生、发展过程中发挥重要作用。腺苷三磷酸(ATP)及其类似物经由激活不同的嘌呤受体影响免疫细胞对炎症的反应,其中P2X7受体(P2X7R)有强的促前炎症因子释放作用,在中枢神经系统,P2X7R表达或功能异常会导致神经元和胶质细胞的损害。Brilliant Blue G(BBG)作为P2X7R强效的非选择性拮抗剂,既往有研究表明BBG可保护PD模型中多巴胺能神经元等,但具体机制尚未阐述。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)是目前较为公认的PD模型造模药物,本研究拟使用MPTP构建PD小鼠模型,探究BBG在PD中的作用及其可能机制。研究目的1.探讨BBG在MPTP小鼠模型中的作用。2.研究MPTP小鼠模型中自噬的变化。3.探讨BBG是否通过自噬在MPTP损伤模型中起到作用。研究方法1.动物选择及分组:选取清洁级的体重和鼠龄均适中的C57/BL6J雄性小鼠(23 g~26 g,8~10周龄),随机分为对照组(Control-生理盐水组)、模型组(MPTP组)、干预组(MPTP+BBG组)、干预对照组(BBG组)。2.模型制备:MPTP组连续5天腹腔注射MPTP溶液;Control组每日相同时间腹腔注射与MPTP溶液等比例的生理盐水(NS);MPTP+BBG组,在注射MPTP溶液前一天及后一天分别腹腔注射BBG溶液;BBG组仅注射等比例的BBG溶液。3.行为学实验:最后一次注射BBG溶液3天后,进行旷场实验、爬杆实验、悬挂试验,检测各组小鼠的运动情况、肌肉力量及焦虑样状态。4.细胞存活和自噬激活:小鼠灌注固定,冰冻切片,进行酪氨酸羟化酶(TH)、p62双标免疫荧光染色,进行TH免疫组化,评价细胞存活、自噬激活的情况。5.相关蛋白的检测:断头取脑,提取蛋白,用Western blot检测TH、α-突触核蛋白(α-syn)、Cleaved Caspase 3、m TOR、p-m TOR、AMPK、p-AMPK、p62、LC3-Ⅱ等蛋白表达量。研究结果1.BBG作为干预对照组,其各种指标与Control组相比无统计学意义(P>0.05)。2.与MPTP组相比,MPTP+BBG组小鼠在旷场中央区活动时间、进入次数明显增加(P<0.05);在爬杆实验中,MPTP+BBG组比MPTP组的调头时间减少(P<0.05)。MPTP+BBG组在悬挂实验中的得分高于MPTP组小鼠(P<0.05),悬挂时间较MPTP组也增加。3.Western Blot结果显示,与MPTP组相比,MPTP+BBG组明显增加了黑质和纹状体中TH的表达(P<0.05)、减少了α-syn的表达(P<0.05)。4.免疫组化结果显示,与Control组相比,MPTP减少了纹状体及黑质的TH数量(P<0.05),而BBG改善了MPTP对TH的损伤(P<0.05)。5.MPTP+BBG组小鼠可见明显的自噬激活现象,与MPTP组相比,BBG干预后组织中p-m TOR、p62蛋白表达降低(P<0.05),而p-AMPK、LC3-Ⅱ蛋白表达升高(P<0.05)。与模型小鼠相比,BBG干预后Cleaved Caspase 3蛋白表达明显降低。荧光共定位显示Control组TH细胞数多,MPTP组TH明显减少,BBG改善了MPTP对TH的损伤。而p62则在MPTP中荧光强度更强(P<0.05),BBG干预后荧光强度减弱(P<0.05)。研究结论1.BBG改善了MPTP小鼠的焦虑状态及运动症状。2.BBG改善了MPTP诱导的小鼠多巴胺能神经元损伤。3.MPTP小鼠模型抑制了自噬通路,而BBG增强了MPTP小鼠纹状体及黑质的自噬,对MPTP损伤模型中起到了保护作用。