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背景:多柔比星（Doxorubicin DOX）又称阿霉素,是一种有效的蒽环类抗肿瘤药物并广泛应用于临床,而阿霉素所致的心脏毒性（DOX-induced cardiotoxicity DIC）引起了临床的高度重视。DIC的发病机制与心肌细胞活性氧（Reactive oxygen species,ROS）生成、线粒体损伤、钙稳态失衡和细胞凋亡等密切相关。SIRT4属于Sirtuins蛋白家族的成员,定位于线粒体。既往研究表明,SIRT4在维持心肌细胞能量代谢、线粒体功能稳态中发挥重要作用。在缺氧诱导心肌细胞损伤模型中,SIRT4表达量下降,过表达SIRT4提高线粒体膜电位活性,抑制心肌细胞凋亡。然而,目前SIRT4在DIC中的作用及机制未见相关文献报道。前期研究发现:在蒽环类药物引起心脏毒性妇女全血RNA测序芯片中SIRT4表达量下降。结合文献及前期结果,我们猜测SIRT4参与DIC发生发展过程并起保护作用。据此,本课题拟从分子,细胞及动物水平三个方面开展研究:首先建立DIC模型,采用基因转染及干扰SIRT4的表达,通过体内实验及体外实验探讨SIRT4在DIC中的作用;其次通过定量PCR,Western blotting、免疫组化及免疫染色等方法,明确SIRT4抑制DIC的具体机制,为减轻DIC提供新思路。第一部分:SIRT4表达与DIC的相关性研究目的:探讨SIRT4表达与DIC的相关性。研究方法:（1）DIC小鼠模型建立我们通过对C57BL/6J小鼠腹腔注射DOX（每周一次,5mg/kg,连用4周,共计20mg/kg）建立心肌损伤小鼠模型,对照组腹腔注射同等剂量的生理盐水（Normal saline NS）。小动物心脏超声检测小鼠心脏功能;小动物生化分析仪检测血清中心肌损伤标志物乳酸脱氢酶（LDH）和肌酸激酶同工酶（CK-MB）水平;HE染色、免疫荧光和TUNEL染色来评价DIC小鼠模型建模是否成功。（2）利用定量PCR及Western blotting方法检测SIRT4基因m RNA和蛋白水平,及凋亡相关蛋白BAX、Bcl2的表达变化。（3）DIC细胞模型建立将H9C2大鼠心肌细胞与DOX（1u M）共孵育24h建立心肌损伤细胞模型。CCK8和Tunel染色来评价DIC细胞模型建模是否成功。（4）定量PCR及Western blotting方法检测SIRT4基因m RNA和蛋白水平,及凋亡相关蛋白BAX、Bcl2表达变化。结果:（1）与对照组相比,C57BL/6J小鼠经腹腔注射DOX后,小动物超声心动图提示LVEF%和LVFS%降低,损伤标志物LDH和CK-MB水平显著升高,心肌组织肌纤维排列紊乱、心肌细胞凋亡增加。（2）与control组相比,DOX处理组小鼠心脏组织中SIRT4 m RNA和蛋白水平表达降低。（3）在DIC细胞模型中,与对照组相比,DOX处理组H9C2心肌细胞活力逐渐降低,细胞凋亡增加。（4）与control组相比,DOX组H9C2心肌细胞中SIRT4 m RNA和蛋白水平表达降低。结论:在DIC模型中SIRT4的转录及蛋白表达水平下降,两者负相关。第二部分:SIRT4在DIC中的作用研究目的:明确SIRT4可能通过调控自噬与凋亡过程参与DIC发生发展的科学假设。研究方法:（1）利用靶向心脏的腺相关病毒载体AAV9构建过表达SIRT4,野生型,及敲低SIRT4表达的小鼠,然后腹腔注射DOX建立DIC动物模型,实验分为五组:NS,NS+AAV9-SIRT4、DOX+AAV9-NC、DOX+AAV9-SIRT4、DOX+AAV9-sh-SIRT4,通过测量小鼠体重,心肌损伤指标,小动物心脏超声,HE染色来评价过表达SIRT4对DIC小鼠的心脏功能及形态学的影响。（2）通过对心脏组织Tunel染色及Western blotting检测来评价过表达SIRT4对DIC小鼠心肌细胞凋亡的影响。（3）利用慢病毒载体lentiviral（Lv）构建过表达SIRT4,空载体,及敲低SIRT4表达的H9C2心肌细胞,然后与1umol/l DOX共孵育24h,建立DIC细胞模型,实验分为五组:control,DOX+Lv-NC、DOX+Lv-SIRT4、DOX+Lv-sh-NC、DOX+Lv-sh-SIRT4,通过对各组心肌细胞进行Tunel染色及Western blotting检测来评价过表达SIRT4对DIC细胞模型中细胞凋亡的影响。（4）通过心脏组织免疫荧光染色及Western blotting检测来评价过表达SIRT4对DIC小鼠细胞自噬的影响。（5）通过对心肌细胞进行免疫荧光染色及Western blotting检测来评价过表达SIRT4对DIC细胞模型自噬的影响。结果:（1）在整个实验周期结束时,无实验动物死亡,DOX+AAV9-sh-SIRT4组和DOX+AAV9-NC组的体重显著低于DOX+AAV9-SIRT4组和对照组。DOX处理组小鼠心肌损伤标志物CK-MB和LDH水平显著高于NS组小鼠,DOX+AAV9-sh-SIRT4组和DOX+AAV9-NC组的CK-MB和LDH水平明显高于DOX+AAV9-SIRT4组。超声心动图结果显示:过表达SIRT4改善了DOX所致的心功能下降,如:与其他组比较,DOX+AAV9-SIRT4组的LVEF%和LVFS%有所增加。HE染色结果显示:与DOX+AAV9-sh-SIRT4组和DOX+AAV9-NC组相比,DOX诱导的心肌萎缩在DOX+AAV9-SIRT4组也得到逆转,心肌细胞显著增大。此外,组织学检查还显示DOX+AAV9-SIRT4组还减少了DOX诱导的心肌细胞空泡样变性。实验结束后,我们还验证了SIRT4在各组小鼠心脏中的表达。NS+AAV9-SIRT4组和DOX+AAV9-SIRT4组的SIRT4高表达,DOX+AAV9-NC组和DOX+AAV9-sh-SIRT4组的SIRT4表达水平降低,而NS组的SIRT4表达水平无变化。（2）Western blotting结果显示DOX处理组小鼠Bcl2/Bax比值明显低于NS组,DOX+AAV9-sh-SIRT4和DOX+AAV9-NC组的Bcl2/Bax比值明显低于DOX+AAV9-SIRT4组。TUNEL染色结果显示:DOX组比NS组TUNEL阳性细胞数明显增多,DOX+AAV9-SIRT4组的TUNEL阳性细胞数明显低于DOX+AAV9-sh-SIRT4和DOX+AAV9-NC这两组。（3）我们进一步通过体外细胞实验验证,过表达SIRT4可减少DOX诱导的心肌细胞凋亡。将不同分组的H9C2细胞暴露于1u M DOX 24h。Western blotting分析显示DOX作用后Bcl2/Bax比值降低,在SIRT4敲低组这种作用更为明显,而DOX+Lv-SIRT4组的Bcl2/Bax比值明显升高。TUNEL染色结果显示DOX组比对照组TUNEL阳性细胞数明显增多,DOX+Lv-sh-SIRT4组和DOX+Lv-NC组这两组的TUNEL阳性细胞数明显多于DOX+Lv-SIRT4组,提示过表达SIRT4可减少DOX诱导的心肌细胞凋亡。（4）Western blotting结果显示在DOX+AAV9-sh-SIRT4和DOX+AAV9-NC组小鼠心脏组织中LC3-II/I和Beclin的表达增加,自噬水平增加,p-mTOR和P62的表达降低。然而,在DOX+AAV9-SIRT4组小鼠心脏组织中,p-mTOR和P62的表达增加,LC3-II/I和Beclin的表达减少,自噬水平降低。免疫荧光分析显示,DOX作用后LC3信号增强,尤其是SIRT4敲低组,而过表达SIRT4组LC3信号减弱。这些结果表明,与SIRT4敲低小鼠和正常小鼠相比,DOX给药后过表达SIRT4小鼠的自噬水平受到抑制,提示自噬可能是SIRT4在DIC进程中一个重要调控过程。（5）体外细胞实验进一步证实,过表达SIRT4可减少DOX诱导的心肌细胞自噬。将不同分组的H9C2细胞暴露于1umol/l DOX 24h。Western blotting分析结果显示:过表达SIRT4组p-mTOR和P62的表达升高,LC3-II/I和Beclin的表达降低,自噬水平下降,相反,在SIRT4敲低组,p-mTOR和P62蛋白水平降低,LC3-II/I和Beclin比值升高,自噬水平升高。免疫荧光分析结果显示DOX暴露后LC3荧光信号增强,SIRT4敲低组信号更明显,过表达SIRT4组LC3荧光信号减弱。这些结果表明,在DIC模型中,DOX激活自噬,SIRT4可抑制DOX诱导的自噬。结论:（1）SIRT4抑制DOX诱导的小鼠心肌损伤;（2）SIRT4抑制体内外DOX诱导的心肌细胞凋亡;（3）SIRT4抑制体内外DOX诱导的心肌细胞自噬。第三部分:SIRT4抑制DIC的机制研究目的:证实SIRT4通过AKT/mTOR/自噬信号通路抑制DIC的科学假设。研究方法:（1）利用靶向心脏的腺相关病毒载体AAV9构建过表达SIRT4,野生型,及敲低SIRT4表达的小鼠,然后腹腔注射DOX建立DIC小鼠模型,实验分为五组:NS,NS+AAV9-SIRT4、DOX+AAV9-NC、DOX+AAV9-SIRT4、DOX+AAV9-sh-SIRT4。利用Western blotting检测各组心脏组织中AKT/mTOR信号通路蛋白的变化,来评价SIRT4对DIC动物模型中AKT/mTOR信号通路的影响。（2）利用Lv载体构建过表达SIRT4,空载体,及敲低SIRT4表达的H9C2心肌细胞,然后与1umol/l DOX共孵育24h,建立DIC细胞模型,实验分为五组:control,DOX+Lv-NC、DOX+Lv-SIRT4、DOX+Lv-sh-NC、DOX+Lv-sh-SIRT4。利用Western blotting检测各组心肌细胞中AKT/mTOR信号通路蛋白的变化,来评价SIRT4对DIC细胞模型中AKT/mTOR信号通路改变的影响。（3）为验证SIRT4是否通过抑制自噬参与DIC进程,本部分实验分为体内实验和体外实验。体外实验分为六组:control,DOX+Lv-NC组,DOX+Lv-SIRT4组,DOX+Lv-sh-NC组,DOX+Lv-sh-SIRT4,DOX+Lv-SIRT4+雷帕霉素（Rapamycin自噬激活剂）组。Western blotting、免疫荧光等方法检测自噬及凋亡相关指标。体内实验分为五组:NS,DOX+AAV9-NC,DOX+AAV9-SIRT4,DOX+AAV9-SIRT4,DOX+AAV9-SIRT4+Rapamycin组。免疫荧光、TUNEL染色和Western blotting等方法检测自噬及凋亡相关表型指标。（4）综上所有的实验结果,为验证SIRT4是否通过调控AKT/mTOR通路参与DOX诱导的心肌损伤,本部分实验分为体内实验和体外实验。体外实验分为六组:control,DOX+Lv-NC组,DOX+Lv-SIRT4组,DOX+Lv-sh-NC组,DOX+Lv-sh-SIRT4,DOX+Lv-SIRT4+AKTi（AKT信号通路抑制剂）组。Western blotting,TUNEL染色和免疫荧光等方法检测自噬及凋亡相关指标。体内实验分为五组:NS,DOX+AAV9-NC,DOX+AAV9-SIRT4,DOX+AAV9-sh-SIRT4,DOX+AAV9-SIRT4+AKTi组。小动物心脏超声、HE染色、生化检测、免疫荧光、Western blotting等方法检测小鼠心肌损伤、自噬及凋亡相关表型指标。结果:（1）体外实验结果表明:与DOX+Lv-NC组和DOX+Lv-sh-SIRT4组这两组比较,DOX+Lv-SIRT4组的TUNEL阳性细胞减少,该保护作用可部分被Rapamycin部分阻断。进一步检测Bax、Bcl2、p-mTOR、mTOR、P62、LC3-II/I和Beclin蛋白表达的变化。结果表明:与DOX+Lv-NC组和DOX+Lv-sh-SIRT4组这两组比较,DOX+Lv-SIRT4组的Bax,LC3-II/I和Beclin的蛋白表达水平降低,Bcl2、P62和p-mTOR的蛋白表达水平升高。DOX+Lv-SIRT4+Rapamycin处理组Bax,LC3-II/I和Beclin蛋白水平升高,而Bcl2、P62和p-mTOR蛋白表达水平下降,提示自噬激活可以部分消除SIRT4保护心肌细胞免受DOX诱导的细胞凋亡。（2）体内实验结果表明:DOX+AAV9-SIRT4+Rapamycin组小鼠的TUNEL阳性细胞数与DOX+AAV9-NC组相当,明显高于DOX+AAV9-SIRT4组的TUNEL阳性细胞数。Western blotting分析结果显示与DOX+AAV9-SIRT4组相比,DOX+AAV9-SIRT4+Rapamycin组Bax,LC3-II/I和Beclin蛋白表达水平升高,Bcl2、P62、p-mTOR和p-AKT蛋白表达水平降低。综上所述,这些发现表明自噬激活可以部分消除过表达SIRT4对DOX诱导的心肌损伤的保护作用。（3）Western blotting结果显示DOX处理组中AKT磷酸化水平明显低于对照组,而过表达SIRT4组的p-AKT表达水平升高,提示过表达SIRT4可激活AKT/mTOR信号通路。我们在体外细胞实验中使用AKTi进行回复实验。Western blotting分析显示:与DOX+Lv-SIRT4组相比,DOX+Lv-SIRT4+AKTi组的Bax,LC3-II/I和Beclin蛋白表达水平升高,Bcl2、P62、p-mTOR和p-AKT蛋白表达水平降低。提示抑制AKT/mTOR信号通路后,过表达SIRT4对DOX诱导的细胞凋亡的保护作用减弱。（4）超声检测显示:DOX+AAV9-SIRT4+AKTi组小鼠与DOX+AAV9-NC组相似表现出心肌收缩功能受损,LVFS%和LVEF%降低,CK-MB和LDH水平明显升高。DOX+AAV9-SIRT4+AKTi组TUNEL阳性细胞数与DOX+AAV9-NC组相当,明显多于DOX+AAV9-SIRT4组TUNEL阳性细胞数。Western blotting分析结果显示:与DOX+AAV9-SIRT4组相比,DOX+AAV9-SIRT4+AKTi的Bax、LC3-II/I和Beclin蛋白表达水平升高,Bcl2、P62、p-mTOR蛋白表达水平降低。显然,AKTi可部分消除过表达SIRT4抗凋亡及抑制自噬的作用。综上所述,SIRT4通过AKT/mTOR/自噬通路抑制DOX诱导的细胞凋亡。结论:SIRT4通过AKT/mTOR/自噬通路在体内外缓解DOX诱导心肌损伤,进而抑制DIC的进程。