蓖麻毒素的提取、纯化以及293a细胞在其毒性作用下的蛋白质组学初步分析

来源 :内蒙古民族大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:donny9707
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以大规模分析蛋白质作为主要研究内容的蛋白质组学是功能基因组研究的主要内容之一,蛋白质组学分析技术取得的重大进步使细胞内全蛋白的组成及其活动规律的研究成为热点。本实验以蓖麻籽为实验材料,采用硫酸铵沉淀法提取了蓖麻毒素粗毒,利用亲和层析与凝胶过滤层析纯化了蓖麻籽中的蓖麻毒素,并从细胞水平研究了蓖麻毒素的毒性作用以及纯化后的蓖麻毒素与标准品在毒性方面的差异。同时应用二维凝胶电泳、肽质量指纹质谱测定、蛋白质数据库比对等蛋白质组学技术研究了纯化后的蓖麻毒素的毒性作用对293a细胞蛋白质组的影响,并对诱导蛋白的类型及其所对应的功能进行了分析。取得了以下研究结果:   采用硫酸铵沉淀法提取了蓖麻毒素的粗毒,应用Sepharose4B柱亲和层析和Sephacryl S-200柱凝胶过滤层析对蓖麻毒素进行了纯化,SDS-PAGE鉴定表明纯化后的蓖麻毒素达到了电泳纯。   用毒素标准品和自制毒素对293a细胞进行毒性实验,将毒素标准品和自制毒素稀释为0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μgml、100μg/ml5个浓度梯度,同时设置空白孔(未接种细胞)和对照组(未接种毒素),结果表明无论是蓖麻毒素标准品还是自制蓖麻毒素.随着攻毒浓度的提高,细胞存活率都呈现下降趋势;攻毒浓度从1μg/ml提高10ug/ml,无论是标准品还是自制毒素,细胞存活率都在该浓度范围内下降最大,并且自制蓖麻毒素的降幅比蓖麻毒素标准品的降幅略大。   用浓度为1μg/ml的毒素对293a细胞攻毒,同时设置对照组(未接种毒素),在倒置显微镜下可见攻毒细胞发生明显的形态变化。提取细胞总蛋白后,以正常293a细胞总蛋白为对照与攻毒293a细胞总蛋白同时进行等电聚焦和2-D凝胶电泳,然后对凝胶进行考马斯亮蓝染色,可以看出攻毒293a细胞的蛋白质组发生明显的调整。选取15个差异表达的蛋白质点进行酶解、质谱鉴定,得到了2种可能与蓖麻毒素运输与毒性作用相关的蛋白质。
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