沟叶结缕草愈伤组织干旱胁迫响应及其矮化突变体变异机理的研究

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沟叶结缕草[Zoysia matrella(L.)Merr.],又名马尼拉草,作为生长力强,观赏性好,整体品质佳的优良暖季型草坪草,在我国南方地区广为应用。因其在养护管理时需要充足供水和定期修剪,花费大量的人工和成本,为了降低供水量和减少修剪频率,降低草坪养护管理成本,本研究利用体细胞无性系变异筛选抗旱和矮化的沟叶结缕草。本研究以重要暖季型草坪草沟叶结缕草为材料,通过外源施加表油菜素内酯(EBL),探究了植物激素油菜素甾醇(BR)对沟叶结缕草体细胞胚胎发生过程的作用,不断优化完善长期离体的愈伤组织培养体系并维持其高效的再生能力。利用PEG-6000模拟干旱胁迫,筛选具有耐旱性的沟叶结缕草体细胞无性系再生植株,并外源施加EBL研究BR提高沟叶结缕草逆境胁迫的作用机理。同时,以沟叶结缕草60Coγ辐射诱变的体细胞无性系矮化突变体为材料,结合形态、生理生化、内源激素水平,利用转录组测序技术(RNA-seq)对沟叶结缕草矮化突变体进行转录组测序,分析植物激素调控沟叶结缕草生长作用的潜在机制,筛选调控沟叶结缕草矮化的候选基因,为进行遗传工程改良,提高优良性状提供分子基础。主要研究结果如下:1、植物激素BR能促进沟叶结缕草体细胞胚胎发生,外源施加EBL对沟叶结缕草愈伤组织的生长和再生有显著的促进作用,随着EBL浓度的升高,愈伤组织及再生植株的生长态势先升高后降低,高浓度的EBL对愈伤组织的生长和再生有抑制作用。经过形态学和生理学对比分析,0.02μmol·L-1 EBL是外源处理的最优浓度,对愈伤组织的增殖率和再生率有很大提升。2、干旱胁迫对沟叶结缕草愈伤组织再生能力有明显抑制作用,通过不同浓度PEG胁迫下对体细胞无性系进行定向筛选,分别在5%PEG以及10%PEG处理中获得具有耐旱性的沟叶结缕草体细胞无性系再生植株。3、植物激素BR能显著提高干旱胁迫下沟叶结缕草的抗旱性,外源EBL能显著缓解并促进沟叶结缕草愈伤组织在干旱胁迫下的再生和生长能力,随着EBL浓度的升高,愈伤组织再生能力先升高后降低。0.05、0.1、0.5μmol·L-1的EBL分别对不同浓度PEG模拟的干旱胁迫下的愈伤组织再生有显著的促进作用,并通过促进干旱胁迫下愈伤组织再生过程中的抗氧化酶CAT、POD、SOD活性以及降低MDA含量来调控植物对干旱胁迫的响应。4、植物激素IAA和ABA可能通过合成、运输及代谢途径,调控60Coγ辐射诱变的沟叶结缕草体细胞无性系突变体矮化。矮化突变体在无性繁殖5年的过程中表型和生理指标维持长期稳定,表现出茎短、叶宽、低矮和叶色深绿的表型,在生理上,矮化突变体的表型变化与CAT、POD、SOD、MDA、木质素和叶绿素等生理反应有关。在测定的4种内源激素中,突变体的IAA和ABA含量均下降。通过对矮化突变体和野生型叶片的转录组比较,发现360个差异表达基因(DEGs),其中62个上调,298个下调。内源激素水平和转录组数据表明,突变体的IAA和ABA含量及相关基因表达量均显著下降,IAA合成(Cytochrome P450)、IAA转运(PIN1)、ABA降解(Abscisic acid 8’-hydroxylase 2-like)、细胞壁发育(CESA1)和膨胀素同源基因等主要的DEGs均下调,表明它们是调控矮化突变体的表型的潜在机制。其中,IAA合成及运输、ABA代谢和膨胀素相关蛋白可能是造成该沟叶结缕草矮化的主要原因。本研究发现0.02μmol·L-1 EBL是外源处理的最优浓度,能显著促进愈伤组织的增殖和再生,在5%PEG以及10%PEG处理中获得具有耐旱性的沟叶结缕草体细胞无性系再生植株,EBL能通过增强干旱胁迫下沟叶结缕草抗氧化酶的活性,提高愈伤组织的抗旱性。IAA合成及运输、ABA代谢和膨胀素相关蛋白可能是造成沟叶结缕草矮化突变体矮化的主要原因。
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