论文部分内容阅读
类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种以慢性进行性关节病变为发病特征的系统性自身免疫病。RA会严重地影响患者的健康和日常生活品质,给我国经济方面和社会方面产生巨大负担,目前已发展成为一个重要的公共卫生问题。目前,RA的发病机制尚未有清楚的解释,现阶段科学研究表明RA主要受遗传因素和环境因素影响。针对RA环境因素进行传统流行病分析,受限于暴露和结局的关联,无法得到因果关系。新兴的分子流行病学能结合现场流行病研究方法和分子诊断技术,通过筛选生物标志物,从分子或者基因层面来研究RA的发病机制,目前已得到广泛应用。最近,越来越多研究表明lncRNA可通过遗传印记、染色体重组、mRNA转录、降解和翻译调控等多种方式参与重要的生物学过程,其中包括了 lncRNA表达参与RA的发生发展。本文旨在通过RA患者lncRNA表达谱数据,构建lncRNA调控网络,筛选出RA相关的lncRNA进行功能验证,发掘lncRNA作为RA生物标志物的潜在价值,从公共卫生角度为RA早期诊断,早期治疗提供指导意义。本研究将从以下两个章节来构建RA相关的lncRNA调控网络,并对与RA相关的lncRNA细胞分子功能进行研究。第一章:借助高通量生物基因芯片技术,检测RA患者和健康对照者外周血单个核细胞中lncRNA和mRNA表达,运用加权基因共表达网络分析和因果推论分析构建lncRNA-mRNA-RA调控关系网络,从网络中筛选有价值的lncRNA在另一人群样本中进行RT-PCR差异表达验证。第二章:从调控网络中选择差异表达验证后的lncRNA,利用慢病毒感染Jurkat细胞构建lnc-E2F3IT1敲减细胞株,围绕lnc-E2F3IT1进一步开展细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、以及RA相关的细胞因子表达研究,从而阐述lnc-E2F3IT1对Jurkat细胞分子功能。第一章 系统筛选RA差异的lncRNA和mRNA并构建调控网络,验证RA差异表达lncRNA研究目的建立lncRNA-mRNA-RA之间的调控网络,在人群样本中验证调控网络中差异表达的lncRNA。研究方法应用高通量生物基因lncRNA和mRNA芯片技术检测RA患者和健康对照者外周血单个核细胞中lncRNA和mRNA表达量,在此基础上通过加权基因共表达网络分析(Weighted Gene Co-expression Network Analysis,WGCNA)和因果推论分析(Causal Inference Tests,CIT)构建lncRNA-mRNA-RA调控关系网络,在调控关系网络里选择5个lncRNA,在另一人群样本中应用RT-PCR验证差异表达lncRNA,筛选出有研究价值的lncRNA。研究结果1.通过应用高通量生物基因芯片技术对25名RA病人和18名健康者外周血单个核细胞进行lncRNA和mRNA检测,一共得到lncRNA探针信息17388条和mRNA探针信息21323条。研究者一共得到符合差异倍数(Fold change,FC)≥2、FDR(False discovery rate)<0.05 的 402 个 lncRNA 和 883 个 mRNA。2.经过加权基因共表达网络分析和因果推论分析后,一共构建了 191条lncRNA-mRNA-RA调控关系链,关系链中共含有20个lncRNA和31个mRNA。3.基于芯片差异表达数据选择了 5个P值显著的lncRNA,包括CYTOR、UC.265、DQ593252、E2F3IT1和INE2。研究者在另一人群样本对这5个lncRNA进行RT-PCR验证,RT-PCR结果显示,UC.265、E2F3IT1和INE2的差异表达具有统计学意义,表达量方向与芯片技术检测结果相同。研究结论通过运用高通量生物基因芯片技术,发现lncRNA表达在RA病人与健康对照人群中存在差异,lncRNA通过与mRNA相互作用影响RA的发病。另外,研究者通过表达谱数据和RT-PCR实验发现UC.265、E2F3IT1和INE2可能是RA潜在的表观遗传生物标志物,在RA的病理机制中发挥作用,可针对其展开进一步的细胞功能研究。第二章 lnc-E2F3IT1在RA中的功能机制研究研究目的基于第一章已有的证据,lnc-E2F3IT1具有较高的差异表达倍数和较低的显著P值。研究者进一步围绕lnc-E2F3IT1对Jurkat细胞的功能作用研究,来探索lnc-E2F3IT1作为生物标志物在RA中的细胞分子功能机制。研究方法构建RA相关lnc-E2F3IT1敲减重组慢病毒细胞株及阴性对照,运用CCK-8细胞增殖毒性检测方法、Annexin V/PI双染法及PI染色的细胞周期检测方法对lnc-E2F3IT1敲减Jurkat细胞株分别进行细胞增殖、细胞凋亡和细胞周期的检测。通过RT-PCR方法检测lnc-E2F3IT1敲减Jurkat细胞株中RA相关细胞因子。研究结果1.与阴性对照组相比,lnc-E2F3IT1敲减组Jurkat细胞增殖速度较慢,在48h后组间差异均具有统计学意义(P<0.05)。2.与阴性对照组相比,lnc-E2F3IT1敲减组Jurkat细胞凋亡率较高,组间差异具有统计学意义(P<0.05)。3.与阴性对照组相比,lnc-E2F3IT1敲减组Jurkat细胞对细胞周期影响为G0/G1阶段和G2/M阶段细胞数量偏多,而S阶段细胞数量偏少。4.lnc-E2F3IT1低表达对RA相关细胞因子IL-1β、IFN-γ、TNF-α表达有正调控作用,对IL-4,IL-10有负调控作用。研究结论lnc-E2F3IT1低表达对Jurkat细胞生长(增殖,凋亡,周期)有影响,lnc-E2F3IT1低表达可以抑制Jurkat细胞增殖,促进Jurkat细胞凋亡,影响Jurkat细胞周期,对RA相关细胞因子表达有调节作用。