MicroRNAs (miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性非编码小RNA,能在转录后水平调控基因的表达,并且与生理病理过程密切相关。随着miRNA在基因水平的调控作用被越来越广泛地发现,对于miRNA的异常表达与肿瘤等发生的相关性也越来越多的被揭示,因此miRNAs的异常表达谱也正被发展成为肿瘤等重大疾病诊断的新型疾病标志物。同时对于一些与疾病发生密切相关的miRNA也已被作为疾病治疗的新型靶标,通过对体内特定miRNA的有效调控有望实现通过一种全新的机制而达到的疾病治疗的效果。由于miRNA作为细胞内的生物功能分子重要性,以miRNA作为生物靶标的化学生物学研究正在兴起,而其中寻找对细胞内miRNA具有调控活性的化学小分子具有重要意义,一方面可以将这些活性小分子作为探针对细胞内miRNA参与的调控网络进行深入的研究,另一方面也可能通过小分子对细胞内与疾病相关的特定miRNA的调控进而发展新型的疾病治疗方法。本论文从寻找对细胞内miRNA具有调控活性的化学小分子入手,通过带有荧光素酶报告基因的活细胞筛选体系获取了多种对细胞内不同miRNA具有不同调控功能的活性小分子,结合化学生物学中的探针分子构建等方法,对不同小分子调控miRNA的机制进行了系统的研究,并探讨了小分子通过对miRNA的调控可实现的生物功能。论文工作围绕三类对细胞内miRNA具有不同调控活性的小分子开展,具体包括：1.广谱抑制细胞内miRNA型探针分子构建及其在细胞内作用机制研究在我们利用基于荧光素酶报告基因的活细胞筛选体系筛选对细胞内不同miRNA具有调控活性的化学小分子的工作中,我们发现从天然来源的芒果苷制备的化学小分子芒果苷元对多种细胞内的不同miRNA均表现出了显著的抑制活性,但小分子的作用机制仅通过细胞生物学的研究方法难以获取直接证据。因此在本部分工作中,在通过对芒果苷元的化学修饰得到了一系列带有烯丙基或炔丙基取代的芒果苷元衍生物中,我们筛选得到了对于胞内miRNA的广谱抑制活性与芒果苷元相当甚至超出的活性小分子探针1a及1b,结合化学生物学的方法研究了这类活性小分子如何在细胞中实现对miRNA广谱抑制的分子机制。由于1a及1b在细胞中对于成熟miRNA的表达量并没有产生显著的影响,我们推测这类小分子主要是通过抑制细胞内的miRNA发挥其调控靶基因的表达的活性,而阻断miRNA与AGO2等形成RISC复合体的功能蛋白的作用是小分子实现对胞内多种miRNA功能抑制的有效方法,因此我们主要研究了小分子1a及1b与细胞内AG02等与miRNA功能密切相关的蛋白间的作用。通过生物正交反应,我们将细胞内与带有炔丙基官能团的活性小分子1a作用的蛋白进行了富集和鉴定,发现AG02是其中的重要组分；同时我们也通过生物正交反应对1a在细胞内的靶标进行了荧光标记,获取了在细胞内1a可能直接结合AG02从而抑制miRNA行使功能的初步证据。本部分工作第一次展示了用带有生物正交官能团的活性小分子确认化学小分子可与AG02结合并进而抑制胞内miRNA的可行性,对于小分子通过广谱抑制miRNA对细胞的凋亡等行为产生的影响我们也进行了一定的探索。2.以选择性抑制肌肉特异性miRNA的活性分子为探针对肌细胞中miRNA相关调控通路的研究基于带荧光素酶报告基因的活细胞筛选体系,我们还在一系列从有机光反应中获取的新结构小分子中筛选得到了一个对于肌肉特异型miRNA,包括miR-133, miR-1和miR-206,具有选择性抑制作用的化学小分子14,在本章工作中我们以这个活性小分子为探针,发现了肌细胞中一种新的miRNA调控转录因子myoD,进而调控myomiR的机制。活性小分子14是从2-甲氧基-1,4-萘醌和炔烃的光化环加成反应得到的主要产物,我们首先在用带荧光素酶报告基因的活细胞筛选体系对化合物的活性评估中发现它能够特异性抑制富集于骨骼肌细胞(myoblast)内的myomiR (miR-133a, miR-1和miR-206)对于其相应的荧光素酶报告基因的表达。进一步对小分子14抑制myomiR的机制进行研究,我们发现此活性分子能够有效降低细胞中前体及前前体myomiR的表达,同时对肌细胞内的分化因子也具有显著抑制活性,由此提示其可能通过抑制myomiR及分化因子上游共同的转录因子myoD发挥功能。对小分子14处理后的C2C12细胞中myoD的mRNA和蛋白表达情况的检测表明该小分子并没有下调myoD的mRNA水平,但却显著抑制了myoD蛋白的表达,这一特殊现象提示C2C12细胞中myoD上游可能有miRNA在转录后水平对myoD基因的表达进行调控。以此为线索,我们结合生物信息学的预测和以小分子14作为探针对myoD上游调控因子的探索,发现在C2C12细胞中myoD蛋白的表达可受到miR-221/222的调控,小分子14能上调miR-221和miR-222的表达,而传统的miRNA靶点验证手段最终也证实了myoD是miR-221和miR-222的靶基因。由此我们通过一个选择性抑制myomiR的活性小分子发现了肌细胞中一种miR-221/222对myoD进行转录后调控,并进而影响myomiR的转录和表达的新机制。3.选择性抑制miR-133a/b的活性小分子的获取及其对成肌和成脂分化进程的影响研究成肌和成脂分化的研究是当前的研究前沿,对于在肌脂代谢和分化过程中具有调控作用的miRNA的研究显示miR-133a可负调控褐色脂肪细胞的分化和能量释放。基于这一背景,在上一章工作的基础之上,通过对小分子结构的化学改造,我们成功地获取了一个在多种细胞中可选择性地抑制miR-133a的活性小分子Z。对于小分子Z在不同位点变换不同的取代基团,并对所获取的化合物进行活性分析,我们找到了在保持化合物的活性前提下分子中可以引入生物正交官能团的位点,并进而通过炔丙基取代获取了一个带有生物正交官能团的活性小分子探针Z’2。对Z’2对不同细胞中miR-133的抑制活性的测试显示其对骨骼肌细胞(C2C12)、白色脂肪前体细胞(3T3-L1)、和皮下白色脂肪前体细胞内的miR-133a/b都有显著的抑制作用。基于miR-133a/b表达的下降能使这些胞内的prdm-16的表达上升,从而诱导细胞转变成帮助释放能量的米黄色或褐色脂肪细胞的报道,我们也对这些细胞在化合物Z’2处理后一些成脂和成肌的生物标记物进行了检测,实验结果显示在小分子Z’2的作用下,细胞内Prdm-16的表达有所降低,同时细胞还表现了往米黄色或褐色脂肪方向分化或转变的倾向。因此该活性小分子有望发展成为一个研究miR-133介导的肌脂代谢调控通路的探针分子,对于小分子在细胞内的作用靶标及调控机制也可通过化学生物学的方法进一步开展研究。