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9012AB是我国上世纪90年代选育的一类甘蓝型油菜新型细胞核雄性不育两型系,它利用临保系成功克服了其它核不育系统在制种过程中需要拔除50%可育株的难题。早期遗传分析表明,9012AB雄性不育性状受三对独立的基因(BnMs3, BnMs4和BnRf)互作控制(陈凤祥等,1998)。而最近的研究发现,BnMs4与BnRf等位,从而将三基因互作修正为双基因控制的隐性核不育(董发明等,2010)。为揭示该不育系雄性不育发生的分子机理,在前期标记定位的基础上,本研究重新构建了与9012AB遗传背景不同的三个定位群体(PopB, PopC和PopD),并通过图谱整合实现了核不育基因Bnms3的精细遗传和物理定位,采用图位克隆和比较基因组学相结合的方法,最终成功分离BnMs3基因。主要结果如下：1.通过对与9012AB遗传背景不同的三个新定位群体8,000余单株的分析,将原来与目标基因BnMs3共分离的标记SCR2和9W21定位于基因的同一侧,分别包含有2个和1个重组单株；而SCR1仍然与BnMs3共分离。MT7则位于BnMs3的另一侧,包含有1个重组单株。根据JBnB004A17的序列在9W21和SCRl之间设计23对SSR引物,其中重组标记BSR73的鉴定进一步将BnMs3的候选区间缩小至39kb。2.利用能有效区分甘蓝和白菜亚基因组的标记DM1检测前期构建的BAC克隆重叠群显示,候选克隆JBnB004A17来源于甘蓝型油菜A10染色体,对应BnMs3的同源区。因而利用该标记扩增BnMs3连锁的片段为探针重新筛选BAC文库并获得12个阳性BAC克隆。指纹图谱分析和标记分型表明,BnMs3候选区间可由6个来源于C9染色体的BAC克隆构建成一个完整的重叠群。测序其中可能包含目标位点的克隆JBnB043L23,获得其约118kb插入的序列。3.基于JBnB043L23和JBnB004A17在标记BSR73和MT7定位区段的差异序列设计新的SCAR和SSR引物,检测BnMs3所位于的甘蓝亚基因组片段的多态性。利用各定位群体的重组单株分析,标记RCP137和RCP145最终将BnMs3限定在JBnB043L23上约9.3kb的物理区段内。4.基因预测显示,9.3kb的候选区间存在一个完整的开放读码框(ORF2)和另外两个读码框(ORF1和ORF3)的部分序列。候选基因遗传转化实验证实ORF1为BnMs3的目标基因,其DNA序列及预测的编码蛋白均与拟南芥基因At5g16620(Tic40)高度同源,因此将BnMs3命名为BnaC9.TlC40.a,突变体Bnms3命名为bnaC9.tic40.a-2,位于A10染色体的高度同源基因则命名为BnaA10.TIC40.a。序列分析表明BnaC9.TIC40.a含有14个外显子,编码一个包含455个氨基酸残基的蛋白,具有丝氨酸／脯氨酸富集结构域、跨膜结构域、TPR结构域和Sti1p/Hop/Hip结构域等4个保守结构域。RT-PCR的分析表明,BnaC9.TIC40.a在9012B的1-5级雄蕊、根、茎、叶和花瓣等各个组织中均存在表达,bnaC9.tic40.a-2和BnaA10.TIC40.a在9012B和9012A的各个组织中亦存在表达。5.从BnMs3野生型材料(9012F),Bnms3突变型材料(9012A和临保系T45),以及两个同源BAC克隆中分别分离两侧最近标记锚定的序列,比较发现9012A中候选区间序列与来源于C9染色体的目标克隆JBnB043L23的相似性仅为79.1%,但与来源于A10染色体的同源克隆JBnB004A17之间相似性却为85.5%。相反,9012F中候选区间序列与JBnB043L23具有93.3%的相似性,与JBnB004A17之间相似性仅为80.8%。该数据暗示着9012A中Bnms3等位基因型很可能是由甘蓝型油菜中A10与C9染色体间的同源重组(homologous recombination)而致。而来源于临保系T45的候选区间序列与JBnB043L23之间的相似度高达99.9%,表明其内的Bnms3等位基因型是由BnMs3等位基因型的少量碱基自然变异所致。因此,不育基因型Bnms3存在两种不同的单倍型。6.临保系T45与野生型材料Tapidor之间在BnaC9.TIC40.a内部只存在2bp的缺失变异,根据该处碱基变异设计的InDel标记RCP170L/R能够很好的区分临保系来源的Bnms3与其它所有材料,表明标记RCP170L/R为临保系T45中Bnma3单倍型的功能标记。而基于9012A和野生型材料Tapidor及9012F中BnaC9.TIC40.a序列差异处开发的共显性标记RCP170L2-3/R2能够很好的区分9012A与其他所有材料。因此,原则上,上述两个标记可准确的鉴别任何分离群体中BnMs3位点的基因型。