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背景肝移植是目前治疗终未期肝病（End-stage liver diseases,ESLD）的唯一有效手段,但是术后排斥是影响移植肝存活的关键因素。临床上虽然有众多的免疫抑制剂,但安全隐患较大。因此,本文研究的是肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor,HGF）调节细胞毒性T细胞（Cytotoxic T lymphocytes,CTLs）CD8+T细胞建立耐受反应的分子机制。众所周知,CD8+T细胞是介导移植排斥反应的主要功能细胞。在CD8+T细胞活化过程中,其自身的抗凋亡化是其发生持续活化的重要保证。因此,CD8+T细胞凋亡通路的激活具有重要意义。CD8+T细胞是主要的靶T细胞,也是器官移植领域的一个研究热点。我们在小鼠DEN肝硬化模型前期研究中发现,输注高分泌HGF的肝脏干细胞（NG2+细胞）治疗组别中,肝硬化程度减轻。在异种肝移植急性排斥反应模型中发现转输NG2+细胞/HGF能明显延长移植受体的存活时间,同时使肝脏、脾脏和外周血中CD8+T细胞的数量下降。有关报道显示,高表达cMet（Met proto-oncogene/Hepatocyte growth factor receptor）的肝细胞在高水平的HGF作用下发生Fas-Fas L系统的凋亡反应,并且HGF是通过与Fas竞争性结合cMet,使肝细胞上“cMet-Fas偶联复合体”解离而诱导细胞发生凋亡。研究员报道,HGF不仅是细胞因子,还可以作为免疫调节剂。根据相关文献,我们证实了CD8+T细胞表面表达cMet,并且高HGF水平可以减少CD8+T细胞细胞表面cMet分子的表达量。于是我们提出假设:“cMet-Fas偶联复合体”存在于CD8+cMet+T细胞表面,通过输注高浓度的HGF能够诱导CD8+cMet+T细胞经过Fas-Fas L途径参与凋亡,形成机体耐受反应。目的1.研究HGF对CD8+T细胞功能的影响,验证诱导CD8+T细胞凋亡;2.阐明HGF建立肝移植免疫耐受的分子机制;3.为临床提供新型免疫抑制药物的应用奠定了坚实的实验基础。方法1.构建异种大鼠肝移植模型,通过输注cHGF（clinically used hepatocyte growth factor,cHGF）和NG2+细胞/HGF治疗处理,比较分析其生存期的差异;采用免疫荧光检测NG2+细胞表达HGF和肝移植受体大鼠肝/脾异种CD8+T细胞的凋亡情况;通过Wstern Blot检测细胞和组织中HGF的表达。2.经陆军军医大学第一附属医院伦理委员会审批,我们收集了6例急性肝移植排斥反应的病例,同时我们还收集了6例切除的肝血管瘤患者远端肝组织标本。苏木素-伊红染色分析12例石蜡组织标本病理状况及排斥反应程度;免疫组化和免疫荧光检测12例标本中HGF和CD8的表达,分析HGF的表达与CD8的关系;免疫荧光检测急性肝移植排斥反应的标本中CD8+T细胞的凋亡情况。3.构建同种异体大鼠肝移植模型,输注cHGF和anti-cMet Ab治疗处理;肝移植术后大鼠肝组织HE染色、肝功能检测和细胞因子检测;大鼠肝脏和脾脏组织免疫荧光染色检测CD8+T细胞的增殖和凋亡状态;大鼠肝脏组织采用免疫组化和Wstern Blot检测HGF和CD8的表达情况,分析HGF的表达与CD8的关系;细胞流式检测大鼠外周血CD8+T细胞和CD4+T细胞的亚群比例;采用表面等离子体共振技术（Surface Plasmon Resonance,SPR）验证HGF与“cMet-Fas偶联复合体”结构和CD8+T细胞功能变化的关系。4.免疫磁珠负分选分离纯化CD8+T细胞,通过流式细胞术检测CD8+T细胞的纯度;在植物血凝素A（Phytohemagglutinin A,PHA）刺激下,分别与不同浓度HGF、不同浓度anti-cMet Ab+cHGF（400ng/m L）进行共培养,检测CD8+T淋巴细胞的克隆团数;免疫荧光实验和CCK-8试剂盒检测不同培养基中CD8+T细胞的增殖活性以及凋亡状态;Annexin V-FITC检测cHGF诱导的CD8+T细胞早期凋亡;DNA Ladder抽提试剂盒检测DNA断裂片段;免疫荧光检测CD8+T细胞表达Fas蛋白;CD8+T细胞中Caspase-8/Caspase-3酶的活性检测,以及采用RT-q PCR检测Fas凋亡相关的基因;IP验证Fas途径介导的凋亡通路。5.流式细胞术检测小鼠CD8+cMet+T淋巴细胞亚群的比例;免疫荧光检测CD8+T细胞表达cMet蛋白;Co-IP技术验证体外CD8+T淋巴细胞在不同状态下,细胞膜上“cMet-Fas偶联复合体”结构的变化对CD8+T细胞功能的影响;通过放射性配体-受体结合（Radioligand receptor binding assays,RRA）实验证明HGF与cMet的结合促进Fas与Fas L的偶联。6.流式细胞术检测人CD8+T细胞的纯度;台盼蓝拒染实验对人CD8+T细胞在不同培养状态下进行活性计数;采用RT-q PCR检测人CD8+T细胞中与Fas凋亡相关的基因;通过Co-IP技术验证cMet-Fas偶联复合体”存在和高浓度HGF调控偶联状态。结果1.输注cHGF和NG2+细胞治疗可明显延长肝移植大鼠的生存期;研究发现NG2+细胞可表达HGF,且NG2+细胞作用后受体大鼠肝组织可高表达HGF;NG2+细胞/HGF和HGF可大量诱导受体大鼠肝/脾异种CD8+T细胞发生凋亡。2.急性肝移植排斥反应组织标本,病理状态严重,排斥反应程度很高。肝血管瘤患者远端肝组织标本,病理状态较轻,无排斥反应;研究发现HGF和CD8的表达具有负相关性,在急性肝移植排斥反应组织标本中极少CD8+T细胞发生凋亡。3.输注cHGF治疗可明显延长肝移植大鼠的生存期,anti-cMet Ab治疗肝移植大鼠可抑制cHGF的免疫耐受作用,增加排斥反应程度;输注cHGF治疗可减轻肝移植大鼠的排斥反应程度,保护肝脏功能状态,抑制炎性细胞因子,提高抑炎细胞因子产生;研究发现HGF和CD8的表达具有负相关性,输注cHGF治疗可抑制肝脏和脾脏中的CD8+T细胞发生增殖并且促进其凋亡;cHGF治疗后大鼠外周血中CD8+T细胞和CD4+T细胞的亚群比例均降低;表面等离子体共振实验证实了HGF影响“cMet-Fas偶联复合体”发生偶联结构变化,而且经此影响CD8+T细胞的功能。4.小鼠外周血CD8+T细胞的纯度为92.4%;研究得知cHGF和anti-cMet Ab的最佳作用浓度分别是终浓度400ng/m L、200ng/m L;免疫荧光实验和CCK-8试剂盒检测结果显示:cHGF抑制CD8+T细胞的增殖,促进其凋亡的发生,并且cMet抗体可以阻断HGF的作用;Annexin V-FITC检测显示,cHGF组别的细胞发生的凋亡最多,其次是抗体cMet组别,PHA组别发生的凋亡最少;琼脂糖凝胶电泳显示,cHGF组别的细胞发生凋亡断裂的DNA Ladder更多;Fas免疫荧光结果显示,cHGF能促进细胞表达Fas蛋白;检测表明cHGF组别中Caspase-3/Caspase-8的酶活性最高;RT-q PCR检测显示,cHGF组别能表达更高的与Fas凋亡通路相关的凋亡基因表达量;IP技术证实了,小鼠CD8+T细胞上存在“cMet-Fas偶联复合体”并且该偶联复合体会受到HGF影响发生偶联变化。5.小鼠CD8+cMet+T淋巴细胞亚群的比例为28.67%;cMet免疫荧光结果显示,CD8+T细胞可高表达cMet蛋白;免疫共沉淀技术证实了,小鼠CD8+T细胞上存在“cMet-Fas偶联复合体”并且该偶联复合体会受到HGF影响发生偶联变化;放射性配体-受体结合实验证实了HGF与cMet的结合促进Fas与Fas L的偶联。6.人外周血CD8+T细胞的纯度是95.03%;台盼蓝拒染法活性计数显示,24h的CD8+T细胞活性最佳,cHGF组别的活性最低;RT-q PCR检测显示,cHGF也能促进人CD8+T细胞高表达与Fas凋亡通路相关的凋亡基因;免疫共沉淀技术证实了,人CD8+T细胞上也存在“cMet-Fas偶联复合体”并且该偶联复合体也可以受到HGF影响发生偶联变化进而影响细胞的功能状态;结论1.证明了“cMet-Fas偶联复合体”存在于CD8+T细胞。2.证明了HGF影响“cMet-Fas偶联复合体”的结合状态,一旦偶联复合体发生解偶联反应,HGF即诱导细胞凋亡进而建立免疫耐受的分子机制。3.HGF是一种潜在的安全的免疫抑制剂。