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体外循环(cardiopulmonary bypass,CPB)技术在心脏直视手术中起到非常重要的作用。尽管手术技术的不断提高、手术器械的不断完善,CPB术后急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)仍是严重并发症之一,死亡率很高。CPB术后各种原因引起的炎症介质的产生和各种细胞因子补体系统被激活,引起一系列炎症反应,肾脏损伤,最后发展为AKI。目前仍是临床医生面临的主要问题。因而需要不断试验新的方法来预防及减轻术后肾损伤。促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)是主要由肾脏产生的有促进红系祖细胞成熟能力造血因子,近年来许多研究表明其可通过抑制全身炎症反应、促进新生血管生成等对肾损伤有一定的保护作用。骨髓间充质干细胞(bone mesenchymalstem cells,BMSCs)是最近研究较热门非造血干细胞,存在于骨髓中,具有多向分化能力和增殖能力的。对其具有的免疫调节、组织修复能力和抗炎作用研究的比较透彻。对肾损伤也有一定的保护作用。两者联合使用在CPB术后肾脏炎症反应中的作用未见报道。本课题主要研究重组人促红细胞生成素联合骨髓间充质干细胞移植对体外循环大鼠肾脏炎症反应的影响。第一部分:大鼠体外循环术后肾脏炎症反应的实验研究目的:建立大鼠体外循环术后肾脏炎症反应的模型,并加以探讨肾脏炎症反应可能机制。材料和方法:选取3-4月雄性SD大鼠16只,均分为2组:对照组(Sham组)、体外循环组(CPB组)。Sham组大鼠只行动静脉穿刺等操作,不行CPB;CPB组大鼠常规行动静脉穿刺并进行CPB术流转1小时。术后24小时取标本,抽取大鼠动脉血,采用自动生化仪检测血清肌酐(creatinine,Cr)及尿素氮(blood ureanitrogen,BUN)含量;用酶联免疫吸附实验法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清中炎性细胞因子白介素-6(interleukin-6,IL-6)、白介素-10(interleukin-10,IL-10)水平;以及用Western Blot法检测肾组织中肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor,TNF-α)、胰岛素样生长因子 1(insulin-like growth factor,IGF-1)的表达,并采用苏木精-伊红染色(HE染色)观察肾脏组织形态结构变化。使用SPSS19.0统计软件处理数据,设a =0.05为检验标准,当P<0.05时认为差异具有统计学意义。结果:HE染色观察可见Sham组肾小球、肾小管结构未见明显异常。CPB组可见肾小管扩张变性,肾小管上皮细胞水肿有空泡,部分凝固性坏死,线粒体肿胀变形,,并可见间质扩张水肿,有炎症细胞浸润,以中性粒细胞为主。肾小球病变不明显。与Sham组相比,术后24小时CPB组大鼠血清BUN及Cr含量均有不同程度升高,有统计学意义(p<0.05);CPB组大鼠血清IL-6炎症因子水平上升,抑炎因子IL-10水平降低,有统计学意义(p<0.05);CPB组大鼠肾组织内TNF-α表达量下降,IGF-1表达量增加。对条带运用灰度测量软件进行测量,他们的变化幅度有统计学意义(p<0.05)。结论:1、本研究改进了传统的大鼠体外循环模型来研究大鼠体外循环肾损伤,该模型经改进后操作更加简单、可靠,能够熟练的建模。2、转流结束后24小时,CPB组大鼠血清Cr、BUN水平显著增高,炎症因子IL-6水平升高,抗炎因子IL-10水平降低。CPB组大鼠体外循环后出现肾脏的炎症反应,以中性粒细胞浸润为主。肾组织内TNF-α表达量升高,IGF-1表达量减低。说明大鼠体外循环后引起了肾脏的炎症反应。第二部分:重组人促红细胞生成素联合骨髓间充质干细胞移植对大鼠体外循环肾脏炎症反应的影响目的:研究重组人促红细胞生成素联合骨髓间充质干细胞移植对大鼠体外循环肾脏炎症反应的影响,并比较两者联合使用与单一使用重组人促红细胞生成素或骨髓间充质干细胞的效果。材料与方法:选取雄性SD大鼠40只,随机分为5组,每组8只:对照组(Sham组)、体外循环组(CPB组)、重组人促红细胞生成素组(EPO组)、骨髓间充质干细胞组(BMSCs组)、重组人促红细胞生成素联合骨髓间充质干细胞组(EPO+BMSCs组)。Sham组常规行动静脉穿刺等建模操作,不行CPB,其余四组常规行动静脉穿刺并建立CPB,循环流量为100ml/(kg.min)并转流维持1小时。术后即刻进行如下处置:BMSCs组:CPB后颈静脉输注含BMSCs1.5×106悬液0.5 11ml。EP0组:CPB后颈静脉注射EP03000IU/kg。EPO+BMSCs组:CPB后颈静脉注射EPO 3000IU/kg+ BMSCs 1.5×106悬液0.5ml。Sham组和CPB组:术后颈静脉输注0.5 ml的生理盐水。实验过程中记录流量血压变化。术后24小时收取标本,抽取动脉血,采用自动生化仪检测血清Cr及BUN含量;用ELISA检测血清中IL-6、IL-10水平;以及用Western Blot法检测肾组织中NF-α、IGF-1的表达,并采用苏木精-伊红染色(HE染色)观察肾脏组织形态变化。使用SPSS19.0统计软件处理数据,设a =0.05为检验标准,当P<0.05时认为差异具有统计学意义。结果:1、与sham组相比,CPB组大鼠血清Cr、BUN水平显著增高,炎症因子IL-6水平升高,抗炎因子IL-10水平降低。CPB组大鼠肾脏病理显示肾小管上皮细胞变性水肿,部分肾小管细胞凝固坏死脱落,间质内有以中性粒细胞为主的炎症细胞浸润。CPB组大鼠肾组织内TNF-α表达量升高,IGF-1表达量减低(P<0.05)。2、体外循环术后,EPO+BMSCs组与单一用EPO组及单一用BMSCs组比较,血清Cr、BUN水平有明显改善,不同程度减低,IL-6水平下降,IL-10水平升高(P<0.05),病理显示肾小管上皮细胞浑浊肿胀减少,间质内炎症细胞浸润也有所减轻,肾组织内TNF-α表达量下降,IGF-1表达量增加(P<0.05),有统计学意义。结论:联合应用EP0和BMSCs,可以减轻体外循环大鼠肾脏炎症反应,减轻肾损伤,其对CPB肾损伤的保护效果优于单一使用EPO或BMSCs。两者表现为协同作用。