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目的:神经发生指神经干细胞（Neural stem cells,NSCs）增殖分化产生新生神经元并整合到大脑神经环路,参与神经功能的过程。研究表明多种内在和外在因素均可以调控神经发生,其中脂质代谢已被证实与神经发生密切相关。脂质的合成主要在内质网中进行,Seipin作为内质网跨膜蛋白对维持脂质稳态具有重要作用。本文以全身性敲除Seipin小鼠（systemic seipinknockout,sKO）为研究对象,观察Seipin介导的脂质代谢稳态失衡对小鼠神经发生的影响,探讨脂质代谢影响神经发生的可能分子机制。由于脂肪组织发挥维持全身代谢的重要作用,其分泌的脂肪因子和提供的脂肪酸等可以调控神经发生。因此,本文运用皮下移植脂肪组织观察改善sKO小鼠的脑内脂稳态对sKO小鼠神经发生的影响并探讨其分子机制。第一部分Seipin缺失对小鼠神经发生的影响方法:1.繁育sKO小鼠,因其携带LacZ报告基因,运用LacZ原位染色检测Seipin在脑内神经发生部位的表达情况,并运用LacZ原位染色和免疫组织化学染色法检测Seipin在神经前体细胞的表达情况。2.1月龄和5月龄sKO小鼠及其同龄对照组小鼠行BrdU（100 mg/kg）腹腔注射,连续注射7d,间隔4周后,运用免疫荧光染色检测小鼠神经发生部位—侧脑室室管膜下区（subventricularzone,SVZ）的细胞增殖期标志物Ki67和早期神经元标志物DCX的阳性细胞数,运用免疫荧光染色实验检测嗅球颗粒层BrdU和NeuN双阳性的细胞反应新生神经元数量,运用嗅觉习惯/去习惯化实验、嗅觉相关的短期记忆实验检测小鼠的嗅觉功能。3.运用免疫荧光染色检测1月龄和5月龄sKO小鼠海马齿状回颗粒下层（subgranular zone,SGZ）Ki67和DCX的阳性细胞数量。运用水迷宫和Y迷宫-自发交替检测小鼠的认知能力。运用黑白箱和旷场检测小鼠的焦虑情绪。4.运用饱和油红O染液检测小鼠脂滴堆积情况,观察Seipin缺失后对神经发生部位脂质稳态的影响。结果:1.在小鼠大脑的嗅球、皮层、侧脑室室管膜下区和海马等区域存在LacZ阳性表达。免疫组织化学染色和LacZ原位染色结果显示LacZ与侧脑室室管膜下区Nestin阳性和DCX阳性的神经前体细胞共定位。2.观察Seipin缺失对SVZ神经发生的影响。免疫荧光染色结果显示1月龄sKO小鼠Ki67+增殖细胞数为17468±2111,较同龄同窝对照小鼠18047±1069无明显改变,DCX+早期神经元数量为18502±1122较对照23370±637明显下降（P＜0.01）,嗅球BrdU+/NeuN+新生神经元数量较对照小鼠无明显差异。嗅觉相关行为学实验结果显示1月龄sKO小鼠较同龄对照小鼠的嗅觉辨别能力和嗅觉相关短期记忆能力无明显差异。检测5月龄sKO小鼠SVZ神经发生水平,实验结果显示5月龄sKO小鼠Ki67+增殖细胞数为9373±829,较同龄同窝对照小鼠13367±686明显下降（P＜0.01）;DCX+早期神经元数量为6933±678较对照小鼠显著降低（P＜0.01）,对嗅球颗粒层细胞进行检测发现sKO小鼠BrdU+/NeuN+的神经元数量为2495±310较对照小鼠3669±305显著下降（P＜0.05）,嗅觉习惯化/去习惯化实验结果显示5月龄sKO小鼠较同龄对照小鼠的嗅觉辨别能力无明显差异,但嗅觉短期记忆实验结果显示5月龄sKO小鼠在间隔60min、90min和120min时,第二次嗅探同一气味的时间较对照小鼠明显延长,提示Seipin缺失降低成年小鼠SVZ神经发生,并且损害成年小鼠的嗅觉识别记忆能力。3.评估Seipin缺失对海马SGZ神经发生的影响。免疫荧光染色结果显示1月龄sKO小鼠Ki67+增殖细胞数为1005±179.4,较同龄同窝对照小鼠1204±340.6无明显改变,而5月龄成年sKO小鼠Ki67+增殖细胞数为272.8±20.9较对照425±53.1明显下降（P＜0.05）。运用免疫荧光染色检测DCX+的新生神经元,结果显示1月龄sKO小鼠DCX+新生神经元数量为4497±315.8较对照小鼠无显著差异,5月龄sKO小鼠SGZ DCX+细胞数为812.7±83.5,较同龄同窝对照小鼠1117±88.7明显下降（P＜0.05）。行为学检测结果显示,1月龄sKO小鼠的认知能力和焦虑情绪较同龄对照组无明显差异,而5月龄sKO小鼠的学习能力和记忆能力均较同龄对照组显著下降（P＜0.05）,旷场和黑白箱实验结果显示5月龄sKO小鼠的焦虑情绪明显加重,以上结果提示Seipin缺失降低小鼠海马神经发生,损害认知并加重小鼠的焦虑情绪。4.饱和油红O染色结果显示,5月龄sKO小鼠的侧脑室以及第三脑室出现脂滴的异常堆积（P＜0.05）。相关性分析结果显示侧脑室的脂滴面积与SVZ组织Ki67+细胞数和DCX+细胞数呈高度负相关,背侧第三脑室的脂滴面积与海马SGZKi67+细胞数和DCX+细胞数呈中度负相关,提示Seipin缺失诱发神经发生障碍可能与脂质稳态失衡有关。第二部分:Seipin缺失导致脂质稳态失衡的分子机制方法:1.制备5月龄sKO小鼠和同龄对照组小鼠SVZ组织的冰冻切片于涂有导电材料的ITO玻片上,并均匀喷涂DHB基质,运用MALDI-MS在正离子模式下分析500～1000m/z范围内的脂质成分,利用SCiLSLab软件靶向SVZ组织进行ROC分析和T检验得到两组差异明显的m/z值,随后将准确的m/z测量值与LIPID MAPS预测工具（http://www.lipomaps.org/.html）进行比较,进行脂质表征。2.收集5月龄sKO小鼠和同龄对照组小鼠的SVZ组织,建立RNA文库,运用高通量转录组测序筛选差异基因,并运用STRING和KOBAS网站对测序结果进行基因功能注释和功能集富分析,运用微生信网站进行数据可视化绘图。结果:1.质谱结果显示5月龄sKO小鼠的SVZ组织离子强度较对照小鼠明显升高,提示脂质分子含量增加。运用SCiLS Lab 2020软件中ROC分析和T-TEST检验分析数据,结果显示显著变化的脂质分子共有371个,主要为磷脂酸（PA）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）和磷脂酰胆碱（PC）等甘油磷脂成分;甘油二酯、甘油三酯等甘油酯成分以及神经酰胺等。其中PC 34:1变化差异最为明显,可以作为5月龄sKO小鼠与同龄对照组小鼠的SVZ组织脂质差异标志物。2.转录组测序结果显示,5月龄sKO小鼠相较于同龄对照小鼠共检测出553个差异基因,其中145个基因显著上调,408个基因显著下调,GO分析显示差异基因显著富集到神经系统发育、对刺激的反应、神经发生以及初级代谢过程。进一步分析初级代谢物的相关GO term条目,结果显示脂质代谢占比达18.7%,仅次于蛋白质代谢,提示脂质代谢可能影响神经发生。利用KOBAS对测序结果进行KEGG分析,结果显示差异基因显著富集于磷脂酶D信号通路、甘油磷脂信号通路、鞘脂信号通路等脂质代谢途径,而这些途径中改变的差异基因主要是丝氨酸/苏氨酸激酶Akt和蛋白激酶C alpha。第三部分:皮下脂肪移植改善Seipin缺失导致的神经发生障碍方法:1.收集同龄野生型小鼠的脂肪组织注入1月龄sKO小鼠及其同龄对照小鼠的背部皮下,间隔4月后通过CT扫描、肉眼观察、HE染色观察移植脂肪组织的存活效果和脂肪细胞形态,以及采用酶联免疫吸附实验检测小鼠血清中的脂联素和瘦素水平评价移植脂肪的功能。2.测定各组小鼠肝重占体重之比,检测血糖、葡萄糖耐量以及胰岛素敏感性评价脂肪移植对sKO小鼠外周糖脂代谢的改善情况。3.sKO小鼠脂肪移植组和假手术组及各自同龄对照组小鼠行BrdU（100 mg/kg/d）腹腔注射,连续注射7 days,间隔4周后运用免疫荧光染色检测细胞增殖期标志物Ki67和早期神经元标志物DCX反应SVZ的细胞增殖能力和分化能力。运用免疫荧光染色检测嗅球BrdU和NeuN双阳性的细胞数量反应SVZ的新生神经元水平,运用嗅觉习惯/去习惯化实验、嗅觉躲避实验和嗅觉相关的短期记忆实验检测小鼠的嗅觉功能,评估脂肪移植对小鼠神经发生的影响。4.运用饱和油红O染液检测小鼠侧脑室脂滴堆积情况,观察脂肪移植对sKO小鼠神经发生部位脂质稳态的影响。5.运用荧光定量PCR实验检测脂肪移植对SVZ组织脂质合成酶基因表达水平的影响。运用蛋白免疫印迹实验观察脂肪移植对Seipin缺失后脂质信号通路变化的丝氨酸/苏氨酸激酶和蛋白激酶C的影响,初步探讨脂肪移植改善Seipin缺失导致的神经发生障碍的分子机制。结果:1.运用小动物活体正电子发射X线透射计算机断层扫描仪对5月龄sKO小鼠假手术组（sKO-sham）,5月龄sKO脂肪移植小鼠（sKO-AT）及其同龄对照组假手术小鼠（WT-sham）,对照组脂肪移植小鼠（WT-AT）进行全身扫描,计算HU值为-100到-300的脂肪组织的体积,结果显示移植脂肪的存活量均值达400mg。肉眼观察sKO-AT组小鼠的移植脂肪血管化明显。HE染色结果显示移植后存活的脂肪组织与WT-sham小组内生脂肪形态一致,脂肪细胞大小均一。酶联免疫吸附实验结果显示sKO-AT组小鼠的脂联素、瘦素等脂肪细胞分泌的脂肪因子水平较sKO-sham组小鼠显著升高（P＜0.05）,以上结果提示构建脂肪移植小鼠模型成功,移植的脂肪组织可以存活并发挥其生理功能。2.称量各组小鼠肝重和体重,结果显示sKO-AT小鼠肝重占体重之比较sKO-sham小鼠显著降低（P＜0.05）,提示脂肪移植显著改善Seipin缺失导致的肝肿大表型。测定各组小鼠血糖,结果显示sKO-sham组小鼠的血糖水平达（10.9±1.1）mmol/L较WT-sham组小鼠（7.3±0.3）mmol/L明显升高,脂肪移植后sKO-AT组小鼠的血糖水平为（7.5±0.9）mmol/L较sKO-sham组小鼠显著降低。葡萄糖耐量实验结果显示sKO-AT组小鼠血糖在糖负荷15min、30min以及60min均显著低于sKO-sham组（P＜0.05）,胰岛素敏感性实验结果显示sKO-AT组小鼠的血糖曲线接近WT组小鼠,较sKO-sham组小鼠明显改善。以上结果提示脂肪移植改善Seipin缺失后的外周糖脂代谢。3.免疫荧光染色检测Ki67+细胞数量观察脂肪移植对小鼠SVZ细胞增殖能力的影响,结果显示sKO-sham组小鼠SVZ Ki67+增殖细胞数为7889±748.2,较WT-sham组小鼠11139±1008显著减少（P＜0.05）,脂肪移植后sKO-AT组小鼠SVZ的Ki67+增殖细胞数为10594±620.3较sKO-sham组小鼠明显改善（P＜0.01）。运用免疫荧光染色检测DCX+细胞数量观察脂肪移植对小鼠NSCs向神经元方向分化的能力影响,结果显示sKO-sham组小鼠DCX+细胞数为5335±164.7,较WT-sham组小鼠7237±576显著减少（P＜0.05）,脂肪移植后sKO-AT组小鼠DCX+增殖细胞数为6447±304.6较sKO-sham组小鼠显著升高（P＜0.01）。BrdU+/NeuN+检测小鼠嗅球颗粒层新生神经元的数量,结果显示sKO-sham组小鼠嗅球颗粒层BrdU+/NeuN+的神经元数量为2488±227.1较WT-sham组小鼠3539±237.4显著减少（P＜0.05）,脂肪移植后sKO-AT组小鼠嗅球颗粒层BrdU+/NeuN+的神经元数量为3139±142.2较sKO-sham组小鼠明显改善（P＜0.01）,以上结果提示脂肪移植可以改善Seipin缺失导致的成年小鼠SVZ神经发生障碍。4.嗅觉习惯化/去习惯化实验结果显示WT-sham、WT-AT、sKO-sham以及sKO-AT小鼠的嗅觉辨别能力均无明显差异,采用嗅觉短期记忆检测小鼠的气味识别和记忆能力,结果显示sKO-sham小鼠在间隔60 min、90 min和120 min时,第二次嗅探同一气味的时间较对照小鼠明显延长（P＜0.05）,而脂肪移植组sKO-AT小鼠第二次嗅探同一气味的时间较sKO-sham组明显降低,嗅觉躲避实验显示给予各组小鼠6%浓度的nTMT,sKO-sham小鼠在躲避区域停留的时间较WT-sham组显著降低（P＜0.05）,脂肪移植后sKO-AT小鼠在躲避区域停留时间较sKO-sham组显著升高（P＜0.05）,提示脂肪移植可以一定程度上恢复Seipin小鼠的嗅觉相关记忆能力,提高嗅觉灵敏度。5.饱和油红O染色结果显示sKO-sham小鼠较WT-sham小鼠SVZ脂滴明显增多,而sKO-AT小鼠较sKO-sham的SVZ脂滴面积明显减少（P＜0.05）,提示脂肪移植可以改善脑组织的脂质代谢稳态。6.荧光定量PCR实验结果显示脂肪移植未改善脂质合成酶的表达,蛋白免疫印迹实验显示,磷酸化Akt水平在Seipin缺失后无明显改变,但是蛋白激酶C alpha过度激活（P＜0.05）。对脂肪移植后SVZ组织进行检测,结果显示脂肪移植使PKCα的表达水平较sKO-sham组显著降低。提示脂肪移植可能通过改善PKCα的活性来影响神经发生。结论:1.Seipin在小鼠中枢神经系统嗅球、SVZ和海马等部位表达,并表达于侧脑室室管膜下区的神经前体细胞。Seipin缺失导致成年小鼠神经发生障碍,嗅觉相关短期记忆能力下降,认知功能受损,焦虑情绪加重。2.Seipin缺失导致成年小鼠侧脑室和第三脑室脂滴异常增加,甘油磷脂、甘油酯和神经酰胺等脂质分子显著堆积,甘油磷脂、鞘脂和磷脂酶D信号通路明显改变。3.脂肪组织移植可改善Seipin缺失小鼠的脑脂质稳态并可能通过调节PKCα蛋白水平改善sKO小鼠的神经发生水平以及相关嗅觉功能。