论文部分内容阅读
硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)是一种由糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖二糖重复单元组成的线性硫酸化糖胺聚糖,作为硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的侧链存在于细胞膜和细胞外基质之中,可与多种生长因子、趋化因子、形态发生素、细胞外基质蛋白等多种类型的蛋白质相互作用,介导细胞信号转导,参与干细胞分化、肿瘤细胞侵袭转移、胚胎发育、病毒感染等多种生物学过程。研究其结构特征及其修饰酶与生物学功能的相关性,将为再生医学发展和肿瘤治疗提供新的理论基础和潜在的新的技术路线。本文以细胞的HS和硫酸化图案编码酶HS硫酸基转移酶的生物学功能为研究对象,主要结果如下:1.建立干细胞分化模型,使用密度梯度离心法纯化大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪分析间充质干细胞表面干性标记的表达,使用化学诱导试剂建立了干细胞成骨分化模型,并通过碱性磷酸酶活性检测和成骨分化标志分子Runx2和Ocn的表达对模型加以确认。使用RT-PCR和Western blot检测大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化前后的HS硫酸基转移酶表达谱。发现当间充质干细胞生长到高汇合度时,对照组和成骨培养体系里都会形成细胞球。通过组织化学染色鉴定这种类型的细胞球是一种钙化的结节。在所有被检测的硫酸基转移酶中,HS6ST3的m RNA和蛋白质表达在这种钙化的细胞球中都上调表达,m RNA相对表达水平由0.70±0.031增至2.13±0.022(p<0.05),相对蛋白表达水平由0.37±0.024增至0.91±0.058(p<0.05);使用RNA干扰技术建立了HS6ST3敲减的骨髓间充质干细胞,这些细胞在成骨分化时的碱性磷酸酶的相对酶活由空白诱导组2.27±0.163降至干扰诱导组1.29±0.146(p<0.05),成骨标志分子Runx2和Ocn的表达水平也显著降低,m RNA相对表达水平分别由0.88±0.064降至0.26±0.025,0.92±0.080降至0.42±0.036(p<0.05),表明HS6ST3是一个与干细胞成骨分化有关的候选酶基因。2.建立肿瘤细胞诱导分化和恶性转化模型,使用全反式维甲酸诱导骨髓异常增生综合症SKM-1细胞株的粒细胞系分化,TGF-b1诱导非小细胞肺癌细胞株A549的上皮—间充质转化。发现SKM-1白血病细胞向粒细胞系分化过程中HS 2-O位硫酸基转移酶(HS2ST1)在m RNA和蛋白质表达水平都下调,HS2ST1的m RNA相对表达水平由0.93±0.057下降到0.32±0.015和0.27±0.017(p<0.05),HS2ST1蛋白的相对表达水平由2.06±0.161下降到0.72±0.047和0.41±0.034(p<0.05),呈现ATRA剂量依赖方式;而在A549细胞上皮—间充质转换过程中HS(氨基葡萄糖)3-O位硫酸基转移酶3A(HS3ST3A)的m RNA和蛋白质表达水平下调,HS3ST3A的m RNA相对表达水平由1.67±0.062分别下降到0.92±0.037,0.67±0.029和0.33±0.044(p<0.05);HS3ST3A相对蛋白表达水平则由0.48±0.031急剧下降到0.28±0.026,0.08±0.004和0.07±0.003(p<0.05),呈现TGF-b1剂量依赖方式,进一步通过RNA干扰技术和体外基质胶侵袭实验证实HS3ST3A与A549细胞体外侵袭转移能力呈负相关,体外基质胶侵袭实验发现干扰组A549癌细胞穿过基质胶侵袭到微孔膜下层的细胞数为1097±57,显著高于空白对照组和阴性对照组的353±31和337±27(p<0.05)。以上结果表明HS2ST1与SKM-1细胞株的粒细胞系分化有关,而HS3ST3A是一个与肺癌细胞侵袭转移有关的候选酶基因。3.制备一系列不同硫酸化图案类型的硫酸乙酰肝素结构类似物,研究其在干细胞成骨和软骨分化过程中的生物相容性和生物活性。首先,高密度发酵和阴离子交换纯化得到硫酸乙酰肝素合成前体Heparosan,然后运用化学法将硫酸基基团加入前体Heparosan骨架的-NH-和/或-OH上,修饰后的硫酸化Heparosan通过FT-IR,1H NMR和13C NMR进行结构确证。细胞活力没有受到硫酸化Heparosan多糖的显著影响。其中,N,O-位同时硫酸化的Heparosan多糖处理细胞后,细胞在软骨诱导分化过程中软骨分化标志分子II型胶原?1亚型(COL2A1)的m RNA表达水平由对照组的0.19±0.017提高到0.52±0.027(p<0.05),而N-位硫酸化和O-位硫酸化没有显著影响,高度硫酸化的肝素抑制干细胞的生长,抑制率18.3%,表明HS多糖促进间充质干细胞的软骨分化活性与其硫酸化图案有关。建立干细胞表面HS糖链特异性去除的细胞模型。构建了一种C-端带有组氨酸标签的肝素酶I表达载体并得到稳定性提高了9倍的肝素酶I,进一步通过SUMO融合技术将其可溶性水平提高了23.6%;通过阳离子交换、G25凝胶过滤制备得到干细胞培养用肝素酶I,发现间充质干细胞在肝素酶I处理之后,生长受到显著抑制,成骨矿化结节显著减小,虽然其碱性磷酸酶活性却显著高于对照组,但是总体依然表明肝素酶I处理后抑制其成骨分化。