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目的:研究显示2型糖尿病患者发生大肠癌的机率较高,且2型糖尿病与大肠癌的发生及发展有密切关系,探讨影响2型糖尿病合并大肠癌发生发展的机制,有利于找寻糖尿病合并大肠癌的治疗靶点。精氨酸特异性单ADP核糖转移酶1(ART1)是重要的单ADP核糖基转移酶,与细胞的多种生物学行为有关。课题组前期研究发现,2型糖尿病合并大肠癌患者癌组织中ART1的表达高于无2型糖尿病的大肠癌患者的癌组织,提示ART1可能在2型糖尿病合并的大肠癌中具有调节作用。此外,有研究报道,β-石竹烯可调节MIN6胰岛细胞的ADP核糖基化因子6(Arf6)引起葡萄糖刺激的胰岛素分泌,且β-石竹烯还可抑制多种肿瘤细胞的生长。在高糖环境下,β-石竹烯是否可通过抑制ART1对大肠癌细胞的糖酵解及增殖、凋亡产生影响,尚未见报道。本课题旨在先前的研究基础上,探讨β-石竹烯是否可抑制ART1促进的糖酵解影响大肠癌细胞增殖和凋亡;同时探讨β-石竹烯抑制ART1促进的糖酵解可能的分子机制,为糖尿病合并大肠癌靶向治疗的选择提供一定的实验依据。方法:本研究分为两部分:1.β-石竹烯抑制ART1促进的糖酵解影响大肠癌增殖和凋亡(1)高糖环境下ART1对大肠癌CT26细胞糖酵解及增殖、凋亡的影响1)高糖环境下ART1对大肠癌CT26细胞乳酸及ATP含量的影响采用乳酸测定试剂盒及ATP检测试剂盒分别检测高糖环境下培养的ART1高表达CT26细胞(ART1-cDNA组)、ART1沉默CT26细胞(ART1-shRNA组)培养上清液中乳酸含量及细胞内ATP含量。(空载体转染的CT26细胞(LV-control组)及未转染的CT26细胞(Un-transfected组)为对照组)2)ART1对糖尿病Balb/c小鼠大肠癌CT26细胞移植瘤生长的影响腹腔注射烟酰胺(NA)和链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病Balb/c小鼠模型,在糖尿病Balb/c小鼠右侧腋窝皮下分别接种四组CT26细胞建立移植瘤模型,观测ART1对糖尿病小鼠移植瘤的影响,并用Western blot检测各组移植瘤中凋亡蛋白Cleaved caspase3、Bax的表达变化。(2)β-石竹烯在高糖环境下对ART1高表达CT26细胞增殖及凋亡的影响1)高糖环境下β-石竹烯对ART1高表达CT26细胞乳酸及ATP的影响高糖环境下,β-石竹烯(50μmol/l)处理ART1高表达CT26细胞后,应用乳酸测定试剂盒及ATP检测试剂盒检测ART1高表达CT26细胞乳酸及ATP的变化。2)高糖环境下β-石竹烯对ART1高表达CT26细胞增殖及凋亡的影响采用CCK8实验,流式细胞术和Hoechst33258凋亡染色检测β-石竹烯对ART1高表达CT26细胞增殖及凋亡的影响。3)β-石竹烯对糖尿病小鼠ART1高表达CT26细胞移植瘤的影响β-石竹烯处理接种了ART1高表达CT26细胞的糖尿病Balb/c小鼠,观察β-石竹烯对移植瘤生长的影响,并用Western blot检测移植瘤组织中凋亡蛋白Cleaved caspase3、Bax的表达情况。2.β-石竹烯抑制ART1促进的糖酵解的分子机制(1)高糖环境下,ART1对大肠癌CT26细胞糖酵解酶及相关因子的影响1)Western blot检测高糖环境下ART1对CT26细胞中AKT、P-AKT、MTOR、P-MTOR、C-MYC的表达和糖酵解酶PDK1、LDHA蛋白表达的影响。2)Western blot检测糖尿病小鼠CT26细胞移植瘤中MTOR、P-MTOR、PDK1、LDHA蛋白表达情况。(2)高糖环境下,β-石竹烯对ART1、糖酵解酶及相关因子的影响1)Western blot检测β-石竹烯对ART1表达的影响。2)Western blot检测β-石竹烯对ART1高表达CT26细胞中AKT、P-AKT、MTOR、P-MTOR、C-MYC、PDK1、LDHA蛋白表达的影响。3)Western blot检测β-石竹烯对糖尿病小鼠CT26细胞移植瘤组织中MTOR、P-MTOR、PDK1、LDHA蛋白表达的影响。结果:1.β-石竹烯抑制ART1促进的糖酵解影响大肠癌增殖和凋亡(1)高糖环境下ART1对大肠癌CT26细胞糖酵解及增殖、凋亡的影响1)高糖环境下ART1对大肠癌CT26细胞乳酸及ATP含量的影响高糖环境下,与空载组和未转染组CT26细胞比较,ART1高表达CT26细胞乳酸和ATP含量增加,ART1沉默的CT26细胞乳酸和ATP含量降低(P<0.05)。2)ART1对糖尿病Balb/c小鼠大肠癌CT26细胞移植瘤生长及凋亡的影响糖尿病移植瘤模型中,与未转染组与转染空载组比较,ART1高表达组移植瘤的体积和重量均增加(P<0.05),ART1沉默组体积和重量均减少(P<0.05);Western blot检测四组移植瘤凋亡蛋白Cleaved caspase3和Bax在ART1高表达组降低(P<0.05),在ART1沉默组增高(P<0.05)。(2)β-石竹烯在高糖环境下对ART1高表达CT26细胞增殖及凋亡的影响1)高糖环境下β-石竹烯对ART1高表达CT26细胞乳酸及ATP的影响与未采用β-石竹烯处理的ART1高表达CT26细胞相比,经过β-石竹烯处理后ART1高表达CT26细胞的乳酸和ATP含量降低(P<0.05)。2)高糖环境下β-石竹烯对ART1高表达CT26细胞增殖及凋亡的影响CCK8法检测结果显示:随着β-石竹烯的浓度及时间增加,ART1高表达的CT26细胞增殖活性降低;流式细胞仪检测细胞周期:β-石竹烯诱导后,ART1高表达的CT26细胞G1期比例增高,S期比例减少,PI指数减少(P<0.05);流式细胞仪及Hoechst 333258染色检测细胞凋亡:β-石竹烯诱导后,ART1高表达CT26细胞凋亡增加(P<0.05)。3)β-石竹烯对糖尿病小鼠ART1高表达CT26细胞移植瘤的影响β-石竹烯处理糖尿病小鼠ART1高表达CT26细胞移植瘤模型后,结果显示β-石竹烯处理组移植瘤的体积减小,重量降低;同时Western blot检测显示β-石竹烯处理组移植瘤中凋亡蛋白Cleaved caspase3和Bax表达增高(P<0.05)。2.β-石竹烯抑制ART1促进的糖酵解的分子机制(1)高糖环境下,ART1对大肠癌CT26细胞糖酵解酶及相关因子的影响1)Western blot检测高糖培养后的四组CT26细胞,结果显示:与未转染组和转染空载组相比,在ART1高表达组中,P-AKT,P-MTOR,C-MYC蛋白及糖酵解酶PDK1和LDHA蛋白表达增加(P<0.05),而在ART1沉默组中降低(P<0.05),其中AKT,MTOR在四组细胞中表达无明显差异(P>0.05)。2)Western blot检测四组糖尿病小鼠CT26细胞移植瘤蛋白结果显示:P-MTOR,PDK1和LDHA蛋白表达在ART1高表达组增高(P<0.05),在ART1沉默组降低(P<0.05);而MTOR蛋白的表达在四组间无明显差异(P>0.05)。(2)高糖环境下,β-石竹烯对ART1高表达CT26细胞糖酵解酶及相关因子的影响1)Western blot结果显示:β-石竹烯处理ART1高表达CT26细胞及糖尿病小鼠移植瘤后均可导致ART1表达降低(P<0.05),同时用PDTC处理ART1高表达CT26细胞也可抑制ART1的表达(P<0.05)。2)Western blot检测高糖环境下β-石竹烯处理的ART1高表达CT26细胞,结果显示:P-AKT,P-MTOR,C-MYC蛋白及糖酵解酶PDK1和LDHA蛋白表达降低(P<0.05),但AKT,MTOR的表达无明显变化(P>0.05)。3)Western blot检测β-石竹烯处理的糖尿病小鼠ART1高表达CT26细胞移植瘤,结果显示:移植瘤蛋白中P-MTOR,PDK1和LDHA表达降低(P<0.05),MTOR的表达无明显变化(P>0.05)。结论:β-石竹烯可抑制高糖环境下大肠癌细胞的增殖和凋亡,其可能通过抑制ART1,进而抑制由ART1促进的AKT/MTOR/C-MYC通路介导的糖酵解而实现。ART1在大肠癌的糖酵解中扮演着重要的角色,β-石竹烯在抗糖尿病合并的大肠癌患者治疗中可能具有重要作用,详尽机制有待进一步研究。