研究目的：组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor,HDACi)作为一种高效低毒的靶向抗肿瘤药物正日益引起人们的广泛关注。目前已知HDAC抑制剂通过抑制组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDACs)调节组蛋白和非组蛋白的乙酰化水平,从而达到调控基因表达的目的,以逆转变异细胞表型、抑制细胞增殖、诱导肿瘤细胞分化和/或凋亡。一方面,HDACi可通过对核心组蛋白的乙酰化,调整染色质结构来实现对全基因表达的影响,即：染色质重塑；另一方面,HDACi通过对参与信号转导和转录的非组蛋白的乙酰化来影响基因的表达,进行其特有的“肿瘤转录治疗”。体内体外试验均表明很多HDACi具有低毒强抗癌作用,目前已有HDACi(SAHA和FK228)作为药物在临床得到了应用。更多的HDACi(MS275、LBH589和PXD101等)则处在相应的药物研发阶段。HDACi选择性作用于变异细胞,除了诱导靶细胞周期阻滞、促分化、诱导凋亡外,还诱导机体的抗肿瘤免疫反应。与传统的化疗药物相比,用HDAC抑制剂对血液和实体肿瘤进行治疗,显示了良好的疗效,副作用很少,具有较大的优势。然而,HDAC抑制剂作为一种新型的靶向抗癌药,其机制尚待进一步阐明。随着分子生物学研究的深入,对各种HDACi抗肿瘤作用机制的深入研究将对更好地认识肿瘤发生机制,选择潜在的药物治疗靶点具有重要价值,并为未来寻找和发现活性更好的抗癌药物奠定基础。本论文主要从两个大的方面探讨HDACi的抗肿瘤机制。一方面,我们发现SAHA(首个被美国FDA批准上市的HDAC抑制剂),通过增强肝癌细胞NK细胞活化受体NKG2D之配体MICA/B分子的表达而提高肝癌细胞对NK细胞杀伤的敏感性,并在研究SAHA上调MICA/B的过程中,发现了miR-17-92基因簇的参与,并对SAHA对MICA和miR-17-92的表观遗传调控机制进行了深入研究。另一方面,我们与山东大学药学院药物化学研究所合作,根据已上市的羟肟酸类HDACi药效团模型全新设计合成了以四氢异喹啉为基础的新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂ZYJ-34,并且通过对ZYJ-34进行结构改造,获得了ZYJ-34的衍生物ZYJ-34a、ZYJ-34b和ZYJ-34c,其中ZYJ-34c表现出很好的抗肿瘤活性,特别是在乳腺癌和结肠癌,其酶抑制活性和体外、体内抑制细胞增殖活性均优于已上市的SAHA,具有重要研究开发价值。本课题在此基础上进一步评估了ZYJ-34c对血液系统肿瘤的抑制活性,并探索其具体的抗癌作用分子机制。研究方法：第一部分SAHA通过表观调控miR-17-92及MICA增强肝癌细胞对NK细胞杀伤的敏感性利用四甲基偶氮唑蓝(MTT)掺入实验发现肝癌细胞经SAHA预处理后对NK细胞的杀伤敏感性增强,流式细胞术证实经SAHA作用后肝癌细胞表面杀伤分子相关配体(MICA/B)的表达增加。利用实时定量PCR方法检测SAHA作用后,肝癌细胞中MICA/B相关miRNA(miR-20a、miR-93、miR-106b)的变化,发现SAHA作用后,这些miRNAs的表达降低,并伴有时间剂量依赖关系；继续用定量PCR方法验证了SAHA对miR-17、miR-18a、miR-19a、pri-miR-17-92以及MCM7的抑制,提示这些miRNAs与它们的宿主基因可能受控于相同的启动子。随后,通过流式细胞术观察分别转染miR-20a、miR-93、miR-106b的模拟物对肝癌细胞表面MICA表达的影响。先用Western Blotting验证SAHA对HDAC的抑制活性。进一步,利用染色质免疫共沉淀(ChIP)技术检测SAHA对MICA、miR-17-92和MCM7基因启动子相关染色质乙酰化组蛋白的影响。利用生物分析工具,根据Promoter2.0预测的miR-17-92启动子序列,构建了miR-17-92启动子萤光素酶报告载体。使用JASPAR数据库和TFSEARCH网站,对miR-17-92启动子区的序列进行转录因子结合位点分析。通过构建p-EGFP-GATA-2过表达载体观察GATA-2对miR-17-92转录的影响。最后,通过Western Blotting检测SAHA对肝癌细胞磷酸化STAT3的影响,定量PCR观察IL-6体外刺激对肝癌细胞miR-20a和pri-miR-17-92表达的影响,ChIP技术证实p-STAT3能够直接结合miR-17-92的启动子,并且SAHA作用后结合减弱,介导了SAHA对miR-17-92簇的抑制。第二部分新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂(ZYJ-34c)诱导白血病细胞周期阻滞及相关机制的研究在体外用WST-1法检测了ZYJ-34c对各种白血病细胞(K562,HL-60和原代分离的急性髓系白血病人骨髓白血病细胞)的增殖抑制活性。流式细胞术检测ZYJ-34c对白血病细胞凋亡和周期的影响。RT-PCR和Western Blotting检测周期凋亡相关分子。Western Blotting检测乙酰化组蛋白H3和H4,以鉴定ZYJ-34c的HDAC抑制活性。染色质免疫共沉淀(ChIP)检测p21WAF1启动子相关染色质区组蛋白的乙酰化水平。构建p21shRNA载体,K562细胞电转后培养48h,再加药,24h后检测细胞周期,以观察沉默p21WAF1对药物诱导的细胞周期阻滞的影响。研究结果：结果一：SAHA通过表观调控miR-17-92及MICA增强肝癌细胞对NK细胞杀伤的敏感性1. SAHA预处理增强肝癌细胞对NK细胞杀伤的敏感性经SAHA作用后,两种肝癌细胞株(HepG2, H7402)表面NK细胞活化性配体MICA/B表达升高,并且NKL细胞对SAHA预处理的两种肝癌细胞株杀伤效率明显高于对照组。2. SAHA能够以剂量依赖的方式抑制肝癌细胞中靶向MICA/B的miRNAs的表达SAHA作用后,两种肝癌细胞株中靶向MICA/B的]miRNAs(miR-20a、miR-93、 miR-106b)表达降低,并伴有剂量依赖性。鉴于这些miRNAs与肿瘤发生关系密切,又受到组蛋白去乙酰化酶抑制剂的表观遗传调控,引起我们极大的关注。3. SAHA以剂量依赖的方式抑制肝癌细胞中这些miRNAs的宿主基因的表达在两种肝癌细胞株中验证了SAHA对miR-17-92基因簇(miR-20a的宿主基因)中位于miR-20a上游的miR-17,miR-18a,miR-19a和pri-miR-17-92(miR-17-92的原始转录本)以及MCM7(miR-93和miR-106b的宿主基因)的抑制,并且伴有明显的时间、剂量依赖性。提示这些miRNAs与它们的宿主基因可能受控于相同的启动子,为下一步研究SAHA对这些miRNA调控的机制提供研究方向和线索。4. miR-20a, miR-93和miR-106b能够抑制肝癌细胞表面MICA的表达两种肝癌细胞株在分别转染了miR-20a、miR-93和miR-106b的模拟物后,表面MICA的表达显著降低。验证了在肝癌细胞系中这些miRNAs对MICA的靶向关系。5. SAHA诱导MICA基因启动子相关染色质乙酰化组蛋白累积,但抑制MCM7基因启动子组蛋白H4的乙酰化水平Western Blotting验证SAHA对HDAC的抑制活性。ChIP技术证实,SAHA能够通过促进MICA基因启动子相关染色质乙酰化组蛋白累积,促进MICA的表达。SAHA作用后,MCM7基因启动子结合的乙酰化组蛋白H4降低。而miR-17-92基因启动子结合的乙酰化组蛋白没有显著变化。6.转录因子GATA-2不参与SAHA对肝癌细胞miR-17-92基因簇的转录抑制成功构建p-EGFP-GATA-2过表达载体,并在HepG2中转染pEGFP-GATA-2过表达载体,Western blotting验证过表达效果。但是过表达GATA-2后,HepG2中成熟miR-20a的表达没有变化。提示GATA-2可能不参与在肝癌细胞中对miR-17-92的调节。GATA-2是否参与白血病细胞中对miR-17-92的调节的实验尚在进行中。7. SAHA通过阻断STAT3的活化抑制miR-17-92簇的转录SAHA抑制肝癌细胞STAT3的磷酸化水平,IL-6活化STAT3后,miR-20a和pri-miR-17-92表达上调,ChIP技术证实p-STAT3能够直接结合miR-17-92的启动子,并且SAHA作用后,结合减弱。8.成功构建miR-17-92启动子萤光素酶报告载体,SAHA增强哺乳动物细胞中重组质粒的表达在pGL3-basic骨架载体上连入miR-17-92启动子区的序列,测序鉴定成功。为后续研究转录因子对miR-17-92启动子活性的影响提供实验平台。在稳定表达绿色荧光蛋白的HepG2细胞(HepG2细胞中转染pEGFP-N1的质粒,经G418筛选后得到)中证实SAHA作用后,HepG2细胞绿色荧光比对照组强。结果二：新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂(ZYJ-34c)诱导白血病细胞周期阻滞及相关机制的研究1. ZYJ-34c具有明显优于阳性对照药SAHA的体外抑制白血病细胞增殖的作用比较两种HDACi对白血病细胞的增殖抑制活性,分别在K562、HL-60和原代分离的急性髓系白血病人骨髓细胞中证明,ZYC-34c显著抑制白血病细胞的增殖,明显优于SAHA.2. ZYJ-34c和SAHA诱导白血病细胞凋亡的能力无明显差异相同处理条件下,在SAHA组和ZYJ-34c组之间,细胞凋亡诱导率无显著差异；对凋亡相关分子表达的影响无显著差异。排除了凋亡介导ZYJ-34c优越的生长抑制作用。3. ZYJ-34c比SAHA具有更强的引起白血病细胞细胞周期阻滞的作用在K562和HL-60细胞中,相比SAHA, ZYJ-34c更强的诱导白血病细胞周期阻滞在G1期。4. ZYJ-34c比SAHA具有更显著的诱导p21WAF1转录和表达的作用检测了一系列周期相关分子,如p21WAF1、p27、p57、c-myc、p53和bcr-abl, ZYJ-34c的更强的细胞周期阻滞作用主要是由对p21WAF1的上调和对bcr-abl的抑制所介导。5. ZYJ-34c更显著地诱导p21WAF1基因启动子相关染色质乙酰化组蛋白累积相比SAHA,ZYJ-34c具有对HDAC更强的抑制活性,ChIP技术证明ZYJ-34c更显著地提高p21WAF1基因启动子相关染色质组蛋白乙酰化的水平。6. ZYJ-34c或SAHA诱导的G1期细胞周期阻滞是p21WAF1依赖的成功构建p21-shRNA,p21-shRNA沉默K562细胞中p21WAF1后,组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导的细胞周期阻滞被严重削弱。7.选择性下调血液系统肿瘤的Cyclin A,可能是SAHA对血液肿瘤比实体肿瘤更加敏感的机制通过比较实体瘤细胞(H7402细胞系)和白血病细胞(K562细胞系),发现白血病细胞系中Cyclin A高表达,并在SAHA作用后,显著下调；而在H7402细胞中本身Cyclin A表达较弱,并在SAHA作用后没有显著变化。结论：研究内容第一部分：1.在肝癌细胞中,组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA的低剂量预处理,能够显著增强肝癌细胞中“压力诱导”分子MICA的表达,通过其与表达活化性受体NKG2D的NK细胞的相互作用,增强其对NK细胞的杀伤敏感性。NK细胞活化性受体的配体的表达上调,能够逆转肿瘤诱导的NK抑制,增强NK细胞的抗肿瘤作用。2.在肝癌细胞中,miR-93和miR-106b是高表达的。一方面,作为癌基因,通过抑制p21WAF1、PTEN、Bim和Rb等抑癌基因,促进肝癌细胞增殖,抑制肝癌细胞分化；另一方面,还通过抑制肿瘤细胞表面MICA的表达,抑制NK细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤。SAHA作用后,通过抑制这些miRNAs,抑制肿瘤细胞的增殖,促进肿瘤细胞分化,还利于肿瘤细胞被识别和杀伤。SAHA通过调控这些miRNAs在抗肿瘤中发挥了双重作用。3. SAHA作用于组蛋白,通过诱导MICA基因启动子区组蛋白乙酰化的累积,促进MICA的表达上调；同时抑制MCM7基因启动子区组蛋白H4的乙酰化水平,对miR-17-92基因启动子区组蛋白乙酰化水平没有影响。可见SAHA作用后,虽然组蛋白乙酰化水平总体升高了,但是对于不同基因的调节具有选择性。4.在肝癌细胞中,STAT3处于活化状态,p-STAT3作用于miR-17-92的启动子区,促进miR-17-92的转录,促进肝癌的恶性发展；SAHA作用后,导致STAT3去磷酸化,抑制miR-17-92的转录。5.组蛋白去乙酰化酶抑制剂可以增强哺乳动物细胞中重组质粒的表达效率。研究内容第二部分：1.本研究鉴定了一种新型的四氢异喹啉类的HDACi,ZYJ-34c,与SAHA相比,ZYJ-34c在白血病细胞中表现出优越的HDACs抑制活性和强有力的生长抑制。2.已知p21WAF1基因转录活性增加与其相关组蛋白的乙酰化状态有关。在人类白血病细胞株中,与SAHA相比,ZYJ-34c更强地诱导p21WAF1基因相关染色质区组蛋白的乙酰化,更显著地诱导p21WAF1的转录和表达,从而引起更强烈的细胞周期阻滞。3.通过转染p21shRNA沉默p21wAF1,证明SAHA或ZYJ-34C诱导的G1期阻滞是p21wAF1依赖的。p21wAF1不仅参与G1期细胞周期阻滞,还参与调控肿瘤细胞的终末分化。此外,ZYJ-34c促进bcr-abl的降解和并抑制其激酶活性。ZYJ-34c不是通过细胞毒作用将白血病细胞直接杀死,而是通过诱导细胞周期阻滞,促进终末分化的方式发挥抗肿瘤作用,是一种对血液系统恶性肿瘤很有前途的高效低毒的新型HDACi。意义：HDACi的免疫调节效应提供了治疗肝癌的一条新的途径,可能通过上调肝癌细胞表面的NK活化性配体(MICA)的表达,使其容易被表达NKG2D的免疫细胞(NK细胞和部分T细胞)识别,并激活相应的免疫效应,从而发挥机体的免疫监视功能,杀伤肿瘤细胞。本研究在肝癌细胞中发现了,组蛋白去乙酰化酶抑制剂引起的组蛋白乙酰化修饰对相关靶蛋白MICA的调控作用。通常认为,组蛋白高乙酰化(Hyper-acetylation)与转录激活相关,而低乙酰化(Hypo-acetylation)则与转录抑制有关。然而在体外细胞实验中,人们发现HDAC抑制剂作用后有不到10%的基因转录活化,与此同时表达增强和表达降低的基因数几乎是相似的,提示非组蛋白的乙酰化在HDACi的基因表达调控中也起着重要的作用。此外,miRNA表观遗传调控的发现开辟了肿瘤治疗的新领域,然而目前人们对miRNA自身调控机制的认识仍较肤浅。本研究探索了组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA在组蛋白高度乙酰化、染色质疏松、活化基因表达的背景下,通过抑制p-STAT3,产生对miR-17-92抑制的机制。这是在探索HDACi对非蛋白编码基因表达调控的确切机制的有益尝试。本研究结合酶活性和肿瘤抑制生长活性,筛选了一系列HDAC活性化合物,针对具有良好抗肿瘤潜力和应用前景的化合物ZYJ-34c,采用多种细胞生物学和分子生物学技术,对其抑制人白血病细胞的作用,阻滞细胞周期和诱导凋亡等细胞生物学效应,进行了分子调控机制探讨。解读了ZYJ-34c引起的组蛋白乙酰化修饰对相关靶蛋白p21WAF1的调控作用。最后,采用构建p21shRNA载体,沉默K562细胞中p21WAF1的表达,证实ZYJ-34c对白血病细胞的周期抑制是p21WAF1介导的。本研究为新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂ZYJ-34c,作为抗肿瘤药物的开发和应用奠定理论基础,为新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂的研发提供了有意义的实验参考。