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木薯块根富含淀粉,是热带及亚热带地区重要的粮食作物,同时木薯淀粉在工业上具有广泛的用途。淀粉粒的大小是影响淀粉特性及其工业应用的重要因素。淀粉体是植物贮藏器官合成及积累淀粉粒的场所,淀粉粒的大小与淀粉体的体积密切相关。淀粉体与叶绿体都由前质体发育而成,它们的分裂与增殖都是在质体分裂相关蛋白的精确调控下完成的,这些蛋白表达量的改变将会干扰质体的正常分裂,形成较大的质体。FtsZ 蛋白(Filamenting temperature-sensitive mutantZ)可以在质体分裂位点聚集形成FtsZ环(Z环)为质体的分裂提供动力,FtsZ是质体分裂的关键基因。本实验室前期已经从木薯基因组中克隆获得3个FtsZ基因(MeFtsZ1、MeFtsZ2-1和MeFtsZ2-2),并发现它们的表达与木薯块根淀粉的积累有关。本研究将木薯3个MeFtsZ基因在拟南芥植株中表达,以探讨MeFtsZ基因在木薯质体分裂过程中的作用;同时利用块根特异启动子,在木薯块根中对MeFtsZ1基因进行过量表达和反义抑制,为最终实现木薯淀粉体及淀粉粒的基因工程遗传改良奠定基础。主要研究结果如下:1.将3个MeFtsZs基因转入拟南芥,在拟南芥中进行了功能分析。利用真空渗入法,将MeFtsZ1-GFP、MeFtsZ2-1-GFP和MeFtsZ2-2-GFP载体转化拟南芥,筛选获得阳性拟南芥植株。表达木薯MeFtsZ基因的拟南芥,叶绿体数目减少,体积增大,MeFtsZ蛋白呈点状、块状或纤丝状分布于拟南芥叶绿体,然而转基因拟南芥的植株形态、叶绿素含量与野生型相比没有发生变化。表明MeFtsZ蛋白的存在,干扰了拟南芥叶绿体Z环的形成,质体分裂过程不能顺利完成。2.在MeFtsZs转基因拟南芥中,分析了 基因的过量表达对与质体分裂相关基因表达的影响。MeFtsZs基因在拟南芥中过量表达,可以影响拟南芥质体分裂相关基因的表达。MeFtsZ2-1和MeFtsZ2-2基因对拟南芥植株中质体分裂相关基因表达的影响相似:AtFtsZ1、AtFtsZ2-1、AtFtsZ2-2、AtARC5、AtARC6、AtSulA 等基因的表达量显著上升,AtARC3、AiMinE1、AtCRL、AtMCD1等基因的表达量显著下降,AtMinD1、AtPD V1、AtPD V2、AtCDP1、AtCLMP等基因的表达量差异不显著。表达MeFtsZ1基因对拟南芥植株中质体分裂相关基因表达,显著降低了AtFtsZ1和AtCRL基因表达量,其余基因表达量没有发生显著差异。3.利用根特异表达启动子,将MeFtsZ1基因在华南8号木薯(SC8)根中进行过量和反义抑制表达,探讨了 MeFtsZ1基因对木薯淀粉体的影响。构建了MeFtsZ1基因的块根过量表达载体pVKH-SpoA-MeFtsZ1和块根反义抑制表达载体pVKH-SpoA-antiMeFtsZ1,通过木薯子叶转化华南8号木薯(SC8),获得转pVKH-SpoA-MeFtsZ1载体的再生株系14个,转pVKH-SpoA-antiMeFtsZ1载体的再生株系13个。通过PCR检测,结果发现4个转pVKH-SpoA-MeFtsZ1载体的再生株系(分别命名为TR-OE1、TR-OE2、TR-OE3、TR-OE4)和5个pVKH-SpoA-antiMeFtsZ1载体的再生株系(分别命名为 TR-T1、TR-T2、TR-T3、TR-T4、TR-T5)为转基因阳性株系。4.转基因组培苗经过炼苗移栽,进行大田种植。利用电子扫描显微镜观察转基因木薯块根淀粉体。结果发现:与非转基因的木薯(SC8)相比,转基因株系TR-OE2和TR-T5的淀粉体和淀粉粒显著增大,并且含有单个淀粉粒的淀粉体增多。Southern-blot分析表明,载体的T-DNA单拷贝整合到TR-OE2和TR-T5株系的基因组中。qPCR分析表明:MeFtsZ1的插入影响了 在木薯块根中的表达,其中过量表达提高了 在木薯中的表达,反义表达降低了 在木薯中的表达;但是该基因的插入并没有影响其它与质体分裂相关基因的表达。5.田间种植第二代TR-OE2和TR-T5转基因木薯株系,并对它们的生长进行了测定。结果发现TR-OE2和TR-T5转基因木薯植株的株高、叶长、叶宽、叶柄长、叶片数、茎粗、块根长度、块根直径、块根数、干物质率均与非转基因的SC8木薯没有显著差异。6.田间种植第二代TR-OE2和TR-T5转基因木薯株系,并对它们的淀粉粒进行了测定。结果发现TR-OE2与SC8块根淀粉含量、直链淀粉、支链淀粉含量没有差别。但抑制MeFtsZ1基因表达的TR-T5株系的淀粉含量略微降低。淀粉粒度分析结果发现,转基因株系的淀粉粒显著增大,TR-T5在20～30 μm范围及>30μm范围的淀粉粒数量显著高于SC8,分别是SC8的2倍和66倍;TR-OE2在>30 μm范围的淀粉粒数量是SC8的24倍。TR-OE2和TR-T5在20～30 μm范围及>30 μm范围的淀粉粒体积显著高于SC8。7.测定转基因植株(TR-OE2、TR-T5)与非转基因植株(SC8)的淀粉合成相关酶的活性(AGPase、GBSS、SSS、SBE),发现它们的活性差异并不显著。表明在块根中过量表达或反义抑制MeFtsZ1基因不会影响淀粉合成关键酶的活性,转基因木薯淀粉粒大小的改变不是由淀粉合成关键酶酶活性变化引起的。8.转基因株系TR-OE2、TR-T5与非转基因SC8的块根淀粉粘度曲线具有明显差别。TR-OE2的峰值粘度(Peak Viscosity)和崩解值(Breskdown)显著降低,糊化温度(Pasting Temperrture)和峰值时间(Peak Time)显著提高,而热糊粘度(Hot Paste Viscosity)、最终粘度(Final Viscosity)和回生值(consistence)没有发生变化;TR-T5的峰值粘度、糊化粘度和最终粘度显著降低,糊化温度显著提高,而崩解值、回生值和峰值时间没有发生变化。表明木薯淀粉粒大小的改变,可以引起淀粉粘度特性的改变。9.转基因株系TR-OE2、TR-T5与非转基因SC8的块根淀粉糊化的热特性曲线具有明显差别。TR-OE2 的起始温度(Onset temperature)、峰值温度(Peak temperature)和结束温度(End temperature)均显著高于SC8;TR-T5的起始温度和结束温度显著低于SC8,峰值温度没有发生改变;TR-OE2、TR-T5和SC8的热焓(Endothermic enthalpy)差异不显著。以上结果表明木薯淀粉粒大小的改变,可以引起淀粉糊化过程中的热力学特性的改变。