菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)抑菌酶解物的制备与作用机理研究

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本文以菲律宾蛤仔为研究对象,筛选有抑菌活性酶解物并优化其酶解工艺:对酶解物进行初步的分级纯化,并研究抑菌活性影响因素、探讨其作用机理。研究结果如下:1、菲律宾蛤仔胃蛋白酶解产物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和副溶血弧菌均有一定的抑菌活性,其中对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌活性最强,对四联微球菌则无明显的抑菌活性。最优酶解工艺条件为:酶解时间2h,温度35℃,pH2,加酶量3000U,料水比1:4。2、菲律宾蛤仔抑菌活性酶解物相分了质量主要分布在5000D以下,相对分子质量小于1000D的组分占27.31%,相对分子质量在1000~3000D之间的组分占42.19%,相对分子质量在3000~5000D之间的组分占28.49%,相对分子质量大于5000D的组分仅占1.91%。菲律宾蛤仔抑菌活性酶解物经超滤杯分级后得到3个组分:组分Ⅰ(3KD<Mr<5KD),组分Ⅱ(1KD<Mr<3KD),组分Ⅲ(Mr <1KD);其中,组分Ⅱ对金黄色匍萄球菌的抑制作用最强,其次是组分Ⅲ(Mr <1KD),组分Ⅰ对金黄色葡萄球菌的抑菌活性最弱。高温、储存时间过长和强碱性环境均会降低组分Ⅱ对金黄色葡萄球菌生长的抑制能力;而紫外线处理对组分Ⅱ的抑菌活性没有影响。3、菲律宾蛤仔抑菌酶解物组分Ⅱ使金黄色葡萄菌和枯草芽孢杆菌的菌落形态发生变化,在对数生长期抑制2种菌的的菌体分裂。研究发现2种菌培养液中蛋白、可溶性糖和紫外吸收物质的含量增加,液电导率升高,还可以检测到碱性磷酸酶、β—半乳糖苷酶的活性,且2种细菌的磷代谢均受到严重阻碍。扫描电镜结果显示:随着菲律宾蛤仔抑菌酶解物组分Ⅱ作用时间的延长,金黄色葡萄球菌菌体细胞间发生结团现象,形状变得不规则,大量细胞粘连在一起,随后大量胞内物质外溢,细胞间的界限完全丧失,几乎融合为一个整体;枯草芽孢杆菌菌体细胞表面变得粗糙,细胞开始粘连,胞间界限变得模糊不清,随后出现破损现象,处理9h后大量胞内物质外泄,仅能从贱存菌体碎片辨别出小部分菌体大概形态,大部分菌体已裂解死亡。透射电镜结果显示:随着菲律宾蛤仔抑菌酶解物组分Ⅱ作用时间的延长,金黄色葡萄球菌菌体表面变得粗糙,细胞质分布不均匀,固缩较严重,中间有颜色较深的团状物质出现,随后大量胞内物质外泄,处理9h后大量菌体裂解死亡;枯草芽孢杆菌菌体细胞开始皱缩,细胞质不均匀分布,开始出现质壁分离现象,随后细胞壁破裂明显,大量胞内物质外泄,仅可以看到残留的模糊核质区,细胞裂解死亡。SDS-PAGE图谱显示,金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌80KD和25KD这两个分子量段的蛋白谱带随着菲律宾蛤仔抑菌酶解物组分Ⅱ作用时间的延长而逐渐变浅,而其它分子量段的蛋白谱带逐渐消失。因此,可以推测菲律宾蛤仔抑菌酶解物组分Ⅱ的作用机理可能是破坏了菌体细胞壁和细胞膜,改变了菌体细胞的通透性,导致大量胞内物质外泄,并进入菌体细胞内部影响其正常的生理代谢,从而引起菌体裂解死亡
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