酿酒酵母在发酵过程中会产生少量的风味酯,虽然这些风味酯的含量极少,但却对酒品至关重要。酿酒酵母通过发酵得到的发酵饮品中含有的风味酯归为两大类:乙酸酯、乙基酯。其中乙基酯(C6-C10)含量虽少,但在给予发酵饮品酒香气方面必不可少,由于乙基酯合成量少且代谢机制复杂,相关研究并不多。本实验为了提高乙基酯含量,专门针对其中脂肪酸合成中的限速步骤:丙二酸单酰辅酶A的合成进行了研究。首先构建了专一响应丙二酸单酰辅酶A合成的生物传感器,在此基础上强化丙二酸单酰辅酶A的合成,进而提高乙基酯的产量。主要研究内容及结论如下:(1)首先建立丙二酸单酰辅酶A生物传感器,用于胞内丙二酸单酰辅酶A的检测。该生物传感器包含有操纵基因和报告基因fapO-eGFP、阻遏基因和入核引导序列FapR-SV40,当阻遏蛋白FapR与丙二酸单酰辅酶A特异结合,并与操纵因子fapO分离时,允许获得RNA聚合酶进行体外转录,该生物传感器中报告蛋白eGFP的比荧光强度与胞内丙二酸单酰辅酶A的浓度成正比。先构建了单拷贝过表达操纵基因和报告基因fapO-eGFP的菌株α-OGs,其比荧光强度比出发菌株AY12α提高了 43.0%。又构建了多拷贝过表达操纵基因和报告基因fapO-eGFP的菌株α-OGm,得到了不同表达强度的重组菌株。由强到弱筛选三株重组菌株α-OGm12、α-OGm18、α-OGm28,它们的比荧光强度比出发菌株AY12α分别提高了 254.4%、75.6%和50.0%。在此基础上构建了单拷贝过表达阻遏基因FapR-SV40的菌株α-OGm12-Rs、α-OGm18-Rs、α-OGm28-Rs,结果显示它们的比荧光强度分别比其对应的出发菌株α-OGmm12、α-OGm18、α-OGm28降低了 52.7%、31.7%、26.3%,说明了阻遏基因FapR-SV40存在一定的阻遏触灭效应,并且α-OGm12-Rs的阻遏触灭效应最好。为了得到阻遏触灭效应更明显的菌株,又构建了双拷贝过表达阻遏基因FapR-SV40的重组菌株α-OGm12-Rd,其比荧光强度比对应的出发菌株α-OGm12降低了 63.9%。最终得到了一株生物传感器菌株(α-OGm12-Rd),借助该菌株比荧光强度的变化专一响应丙二酸单酰辅酶A的合成量,为后期强化丙二酸单酰辅酶A的合成提供了专一、灵敏且简便的检测方法。(2)验证建立的丙二酸单酰辅酶A的生物传感器。通过分别构建整合过表达ACC1、磷酸化突变的ACC1ser(659,1157)菌株(αOR-ACC1、αOR-ACC1*)以及游离过表达 ACC1ser(659,1157)菌株(αOR-yACC1*),结果显示,αOR-ACC1、αOR-ACC1*、αOR-yACC1*菌株的比荧光强度分别比出发菌株α-OGm12-Rd提高了 20.1%、94.7%、98.9%。符合预期,证明了本实验构建的丙二酸单酰辅酶A生物传感器的可用性。(3)借助前期构建的生物传感器,强化丙二酸单酰辅酶A的合成。在整合过表达ACC1ser(659,1157)的基础上分别构建了过表达PMP1、TPI1菌株,即αORA1*-PMP1、αORA1*-TPI1。结果显示,αORA1*-PMP1、αORA1*-TPI1的比荧光强度分别比出发菌株αOR-ACC1*提高了 29.1%、2.6%强化了酿酒酵母脂肪酸合成途径中丙二酸单酰辅酶A的合成。