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结直肠癌（CRC）已经成为世界上发病率和死亡率排名第三的恶性肿瘤,每年造成超过五十万例患者的死亡。许多研究人员试图揭示NRF2在结直肠癌中的复杂作用。转录因子NRF2在结直肠癌中起着双刃剑的作用。5-氟尿嘧啶（5-Fu）和喜树碱（CPT）是治疗结直肠癌最常用的化疗药物。不幸的是,多药耐药仍然是结直肠癌有效化疗的主要障碍之一。几项研究揭示了NRF2过度表达与结直肠癌患者对5-Fu耐药增加之间的关系。另有研究表明,乳腺癌对紫杉醇的耐药性也与NRF2的过度表达有关。在本研究中,我们主要研究了结直肠癌细胞对喜树碱和紫杉醇耐药性的分子机制。NRF2是调节细胞内稳态的重要转录因子。NRF2通过识别启动子中的抗氧化反应元件（AREs）来调节下游基因的转录。这些基因编码了参与各种病理生理过程的酶,形成了交叉互作的酶网络。在细胞稳态条件下,NRF2的蛋白水平和转录活性相对较低。目前研究发现,三个E3泛素连接酶复合物能够调控NRF2的泛素化和蛋白酶体降解。尽管NRF2的E3泛素连接酶及其泛素化过程已经得到了充分的研究,但是调节NRF2稳定性的去泛素化酶（DUBs）却仍然是未知的。因此,调节NRF2活性的DUBs将有助于探索NRF2-ARE信号的调节网络。在本课题中,首先对实验室构建的DUB蛋白表达库进行Western筛选,筛选结果发现,其中有一些DUB对NRF2都有一定程度的稳定作用。为了缩小范围,我们选取稳定作用排名前十的DUB进行进一步的验证实验。实验结果表明,DUB3对NRF2的稳定作用最强效果最稳定,因此我们靶向DUB3进行后续的研究。DUB3属于高度保守的人类DUB/USP17家族的一员,能够在细胞因子刺激下被诱导表达。DUB3中89位的Cys是去泛素化酶的活性位点,将Cys突变成Ser(DUB3C89S)能够阻断其去泛素化酶的催化活性。近年来,越来越多的研究证据表明,DUB3在多种细胞过程和疾病中起着重要的作用。肿瘤中DUB3的高水平表达能够调节细胞增殖、转移和上皮-间充质转化,这表明DUB3可能是治疗肿瘤的潜在靶点。在本课题中,我们对收集到的24对结直肠癌病人癌与癌旁组织样品进行Western检测,发现DUB3和NRF2的表达具有正相关性,并且都具有在癌组织中高表达的倾向。同时,我们在7种结直肠癌细胞系中也验证了这一结论,并且选择HCT116和RKO细胞进行后续的分子实验。我们在细胞实验中发现,DUB3能够上调NRF2的蛋白水平和转录活性,并激活NRF2-ARE信号通路,并且这种激活作用依赖于DUB3的去泛素化酶活性。同时,我们排除了DUB3对NRF2转录水平的影响,发现DUB3并不影响NRF2的mRNA水平。进一步为了验证二者之间的关系,我们通过IP等试验证明DUB3、NRF2和KEAP1可能形成一个复合物来调节NRF2的动态平衡。DUB3依赖其去泛素化酶活性,通过去除NRF2的K48连接的泛素化来保护NRF2不受蛋白酶体所降解。随后,我们探索DUB3稳定NRF2之后对细胞产生的影响。实验结果表明,DUB3通过稳定NRF2能够使结直肠癌细胞系产生对紫杉醇和喜树碱产生化疗耐药性。在本研究中,我们首次报道稳定NRF2蛋白水平的去泛素化酶是DUB3。DUB3通过与NRF2和KEAP1形成复合物来降低NRF2的K48连接的泛素化水平并促进NRF2的稳定性。更重要的是,我们揭示了DUB3通过促进NRF2的稳定性使结直肠癌细胞系产生化疗耐药的分子机制。我们的研究填补了NRF2去泛素化系统研究的空白,并为治疗结直肠癌和其他NRF2相关疾病的化疗耐药性提供新的策略。